血清miR-141對結直腸癌的診斷價值及根治性切除術后水平的變化

周巖 豆發福 周亞東 沈振

在許多疾病中,微小RNAs(miRNAs)似乎是一個很有前途的靶分子[1]。研究表明,人體各種體液中存在大量無細胞miRNAs,可用于結直腸癌(CRC)早期診斷及預后預測[2]。本研究采用微陣列分析和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證對CRC病人和非癌對照者的血清樣本進行分析,識別最可能用于CRC篩查或早期檢測的新型、基于血清的生物標志物。

對象和方法

一、對象

2019年4月～2021年3月我院CRC病人手術組織和血清樣本75例(CRC組),男性40例,中位年齡67.8歲。同期20例因腹股溝疝而接受手術的病人組織和血清樣本20例(對照組),男性14例,中位年齡65.2歲。CRC病人均行手術治療,包括開腹手術、結腸切除術或僅進行組織病理學分析的活組織檢查(不進行切除);均經病理和細胞學診斷證實。腫瘤體積為64.0 cm3(范圍:1.0～1 650 cm3)。排除自身免疫性疾病、心血管疾病、嚴重肝腎疾病、血液病和傳染病,以及服用免疫抑制藥物者。本研究獲得了醫院機構審查委員的批準。所有研究者均簽署書面知情同意書。

二、方法

1.標本采集:在術前24小時和術后第3天,采集5 ml空腹外周血樣本,4 ℃下以1 500 r/min離心10分鐘,儲存在-80 ℃,待檢。

2.血清和組織miRNAs提取:將1 ml血清或10 μg組織樣本與750 μl Trizol LS試劑混合,純化總RNA后,10 μl無核酸酶水溶解。采用NanoDrop N-100分光光度計和Quanti-iT核糖綠RNA分析試劑盒測定RNA濃度。采用Agilent 2100生物分析儀和小型RNA微陣列分析RNA質量。

3.miRNA微陣列分析:采用安捷倫miRNA標記試劑用pCp-Cy3標記總RNA,與人類miRNA寡核苷酸微陣列雜交?；虮磉_洗滌緩沖液試劑盒洗滌陣列,并用安捷倫DNA微陣列掃描儀掃描。采用特征提取軟件對原始數據進行數字轉換后,采用GeneSpring GX軟件進行數據分析。將微陣列上斑點的信號強度標準化為陣列的總信號強度,并以百分比表示。

4.qRT-PCR驗證 :采用MultiScribe逆轉錄酶和miRNA特異性引物對血清miRNA進行逆轉錄。采用TaqMan microRNA試劑盒和7300實時PCR系統通過實時PCR對miR-141進行定量。評估樣本中miR-141相對檢測水平,以2-ΔΔCT法計算。Cel-miR-39作為內標物。

三、統計學方法

采用SPSS 25.0軟件分析數據。不符合正態分布的計量資料用中位值(四分位距)描述,采用Mann-Whitney檢驗或Wilcoxon檢驗。二分類變量用例(頻數)描述,進行χ2檢驗。miR-142-3p診斷CRC的最佳截止值用受試者工作特征(ROC)曲線和曲線下面積(AUC)確定。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1.miRNAs微陣列分析:在所有檢測的組織樣本中,共檢測到164個miRNA,其中CRC組織樣本中69個miRNAs顯著上調(P<0.05,圖1A);此外,CRC血清樣本中52個miRNAs的表達量高于對照組(P<0.05,圖1B)。然而只有12種miRNAs同時在CRC組織和血清樣本中表達上調,其中miR-141上調最顯著(圖1C)。

2.qRT-PCR檢測血清樣本中miR-141表達水平:CRC組病人術前血清miR-141相對表達量顯著高于非癌對照組[2.50(1.06,3.12)vs.0.97(0.68,1.21),Z=-5.842,P<0.05]。經ROC曲線分析,術前血清miR-141用于診斷CRC的AUC為0.927(95%CI:0.862～0.992,圖2A),當血清miR-141≥1.418時,用于區分CRC組和非癌對照組人群時的準確性為90.53%,敏感性和特異性分別為89.33%和95.0%。當血清癌胚抗原(CEA)和糖類抗原-199(CA-199)高于正常閾值(CEA≥5 ng/ml,CA-199≥37 U/ml)時,CRC診斷的準確性分別為62.11%和63.16%。聯合檢測血清miR-141、CEA、CA-199,可將常規腫瘤標志物(CEA+CA-199)的診斷AUC值提高至0.944(95%CI:0.899～0.998,圖2B)。

A:血清miR-141診斷CRC的ROC曲線; B:血清miR-141、CEA、CA-19-9三者聯合診斷CRC的ROC曲線圖

3.手術對血清miR-141表達的影響:對照組術后血清miR-141相對表達量為0.84(0.74,1.02),與術前[0.97(0.68,1.21)]比較,差異無統計學意義(P>0.05)。CRC組術后血清miR-141相對表達量為1.90(1.32,2.28),低于術前[2.50(1.06,3.12),P<0.05]。對于CRC組病人,接受根治性切除者術后血清miR-141相對表達量顯著低于術前[1.85(1.29,2.22)vs.2.55(2.07,3.18),P<0.05],對于未接受根治性切除術者,術后血清miR-141相對表達量略低于術前[2.28(1.72,2.74)vs.2.45(2.06,2.85)],但差異無統計學意義(P>0.05)。

4.CRC病人術前血清miR-141表達與臨床病理特征的關系:根據血清miR-141表達水平的中位值,將CRC病人分為低表達亞組(≤2.50,37例)和高表達亞組(>2.50,38例)。CRC病人血清miR-141表達水平與腫瘤UICC分期、Dukes分期和組織學分級有關(P<0.05),與其他臨床特征無關(P>0.05)。見表1。

表1 CRC病人術前血清miR-141表達水平與臨床特征的關系(例)

討論

miRNA在癌癥中表達及臨床意義是目前研究熱點之一[1-2]。本研究結果表明,164種miRNAs在CRC組織中表達上調,然而其中多數miRNAs的內源性表達水平在CRC組血清樣本中沒有上調,這表明腫瘤組織和血清樣本中miRNAs表達譜并不完全一致,CRC細胞似乎只是將一部分miRNAs分泌到體液循環中。miR-141是一種與癌癥相關的miRNA,它在CRC組織樣本和血清中均表達上調,這表明miR-141可能參與CRC的發生和進展,而且血清miR-141對于CRC診斷的準確性較高。

CRC細胞增殖、遷移和侵襲是一個多基因參與的過程,其中包括腫瘤抑制基因的失活和癌基因的激活[3]。miRNA可通過調節癌基因或抑癌基因,在腫瘤細胞增殖、侵襲、凋亡和耐藥性等惡性過程中發揮重要作用[4-5]。研究表明,miR-141可以調節各種腫瘤細胞的生物學功能,但是不同組織中miR-141的調控作用存在較大差異。例如,與非骨轉移性前列腺癌比較,miR-141在骨轉移性前列腺癌中表達下調,且miR-141通過抑制前列腺癌骨轉移中的NF-κB通路發揮腫瘤抑制作用[6]。Li等[7]研究發現,miR-141可抑制膠質瘤細胞的增殖并促進膠質瘤細胞的凋亡。有研究表明,miR-141在多種癌癥中上調,并作為致癌miRNA發揮作用。Li等[8]研究發現,宮頸癌組織中miR-141表達高于正常宮頸組織。miR-141過度表達也被證明能促進鼻咽癌、卵巢癌和CRC的生長[9-10]。本研究發現,miR-141在CRC組織和血清中的表達上調,且與腫瘤分期和組織分化有關,說明miR-141可能是CRC診斷和治療的候選靶點。

手術切除原發性腫瘤灶后,CRC血清miR-141水平顯著下調,表明miR-141是由腫瘤細胞分泌的,當然并不能排除miR-141也由其他細胞分泌的可能性。ROC曲線確定miR-141的高靈敏度和特異性,說明其可作為診斷生物標志物的使用。當血清miR-141≥1.418時,區分CRC組和對照組人群的準確性為90.53%。而CEA、CA-199診斷的準確性僅為62.11%和63.16%[11],聯合檢測血清miR-141、CEA、CA-199可提高常規腫瘤標志物的臨床診斷價值。

本研究證實了miR-141對于CRC的診斷有較高的準確性,但缺少隨訪證據,無法證實其在病人預后中的作用。本研究只能間接解釋血清中部分miR-141來源于腫瘤組織,但是其來源問題尚不能完全明確。

總之,血清miR-141對CRC的診斷具有良好的敏感性和特異性,聯合常規腫瘤標志物檢測可提高常規腫瘤標志物的診斷準確性。