狗脊多糖調控lncRNA NEAT1延緩椎間盤終板軟骨細胞衰老的作用研究

付長龍 涂海水 張文鍵 陳毅濤 陸詩雨 李超 金靈璐 鄭春松

【摘 要】目的：探討狗脊多糖通過調節lncRNA NEAT1延緩椎間盤終板軟骨細胞衰老的作用機制。方法：將15只C57BL/6小鼠的椎間盤終板軟骨細胞進行體外培養；經10 ng·mL-1白細胞介素-1β（IL-1β）干預24 h誘導軟骨細胞；將軟骨細胞隨機分為空白對照組、模型對照組（10 ng·mL-1 IL-1β）和狗脊多糖各劑量組（100，200，400 μg·mL-1）；Real-time PCR及Western blot分別檢測狗脊多糖對IL-1β誘導軟骨細胞lncRNA NEAT1、衰老相關通路p53-p21中p53、p21水平及衰老相關分泌表型的基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）、CollagenⅡ、Caspase-3蛋白表達情況；流式細胞術檢測各組軟骨細胞凋亡率情況。結果：Real-time PCR結果顯示，經IL-1β誘導的椎間盤終板軟骨細胞中lncRNA NEAT1、p21、p53水平顯著增高；與模型對照組比較，狗脊多糖各劑量組lncRNA NEAT1、p21、p53水平顯著降低；與空白對照組比較，經IL-1β誘導的椎間盤終板軟骨細胞中MMP-13、Caspase-3蛋白表達含量顯著增高，CollagenⅡ蛋白表達降低；經狗脊多糖干預后，可顯著改善MMP-13、CollagenⅡ、Caspase-3蛋白表達；此外，與模型對照組比較，狗脊多糖各劑量組椎間盤終板軟骨細胞凋亡率呈現下降趨勢。結論：狗脊多糖通過調控lncRNA NEAT1影響p53、p21、MMP-13、CollagenⅡ、Caspase-3表達，降低軟骨細胞凋亡率，進而延緩椎間盤終板軟骨細胞衰老。

【關鍵詞】 椎間盤退變；狗脊多糖；軟骨細胞；長鏈非編碼RNA NEAT1；衰老；小鼠

The Effect of Cibotium Barometz Polysaccharides Regulating lncRNA NEAT1 to Delay the Aging of Intervertebral Disc Endplate Chondrocytes

FU Chang-long，TU Hai-shui，ZHANG Wen-jian，CHEN Yi-tao，LU Shi-yu，LI Chao，JIN Ling-lu，ZHENG

Chun-song

【ABSTRACT】Objective：To explore the mechanism of cibotium barometz polysaccharides in delaying the aging of intervertebral disc endplate chondrocytes by regulating lncRNA NEAT1.Methods：The intervertebral disc endplate chondrocytes of 15 C57BL/6 mice were cultured in vitro.10 ng·mL-1 of interleukin-1β（IL-1β）was used for intervention for 24 hours to induce chondrocytes.Chondrocytes were randomly divided into a blank control group and a model control group（10 ng·mL-1 IL-1β）and different dosage groups of cibotium barometz polysaccharides（100，200，400 μg·mL-1）.Real time PCR and Western blot were used to detect the effect of cibotium barometz polysaccharides on IL-1β induced lncRNA NEAT1，the levels of p53，p21 in aging related pathway p53-p21 and the expression of aging related secretory phenotype MMP-13，

CollagenⅡ，and Caspase-3 protein.Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of chondrocytes in each group.Results：Real time PCR results showed that the levels of lncRNA NEAT1，p21 and p53 in IL-1β induced intervertebral disc endplate chondrocytes were significantly increased;compared with the model control group，the levels of lncRNA NEAT1，p21，and p53 in each dose group of cibotium barometz polysaccharides were significantly reduced;compared with the blank control group，the expression levels of MMP-13 and Caspase-3 proteins in IL-1β induced intervertebral disc endplate chondrocytes were significantly increased，while the expression of CollagenⅡ protein was reduced.After intervention with cibotium barometz polysaccharides，the expression of MMP-13，CollagenⅡ，and Caspase-3 proteins could be significantly improved.In addition，compared with the model control group，the apoptosis rate of intervertebral disc endplate chondrocytes in the cibotium barometz polysaccharide group showed a decreasing trend.Conclusion：Cibotium barometz polysaccharides affect the expression of p53，p21，MMP-13，Collagen Ⅱ，and Caspase-3 by regulating lncRNA NEAT1，reducing the apoptosis rate of chondrocytes and delaying the aging of intervertebral disc endplate chondrocytes.

【Keywords】 intervertebral disc degeneration;cibotium barometz polysaccharides;chondrocytes;lncRNA NEAT1;aging;mice

脊柱關節處椎間盤退變是引起患者軀干部疼痛的重要原因之一。隨著椎間盤退變的加劇可導致多種脊柱關節疾病的發生、發展［1］。鑒于軟骨終板為椎間盤（缺乏血供組織）提供了絕大多數營養，一旦軟骨終板受不良因素（異常力學、炎癥等）誘導，可破壞其正常結構與功能穩態，進而導致椎間盤退變。細胞衰老通常是機體應對細胞損傷后的應激反應，但在過度損傷及年齡增長等因素刺激下，原有的衰老-清除-再生程序發生失衡，加劇細胞出現或進入周期阻滯狀態，同時誘導衰老相關標志物表達異常及衰老相關通路（例如p53-p21、p16等）處于激活狀態，對機體退變產生重要影響［2-3］。終板軟骨細胞衰老在加劇椎間盤退變過程中扮演了重要角色［4］。另有研究發現，長鏈非編碼RNA（lncRNA）NEAT1在調控骨關節疾病的進程中發揮了重要作用［5］。

課題組既往研究證實，狗脊多糖可改善關節軟骨細胞中Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2含量及一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）水平，延緩椎間盤軟骨細胞退變［6］。此外，狗脊多糖可影響基質金屬蛋白酶（MMPs）-3、解整合素金屬肽酶-4、解整合素金屬肽酶-5、聚集蛋白多糖表達，維持軟骨細胞外基質趨于穩態［7］。因此，本研究從lncRNA NEAT1調控細胞衰老角度，進一步探討狗脊多糖對軟骨細胞衰老相關通路及衰老相關分泌表型因子調控的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康SPF級3周齡C57BL/6小鼠15只，雄性，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物生產許可證號SCXK（滬）

2017-0005；清潔級醫學實驗動物環境設施由福建中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號SYXK（閩）2019-0007。動物處置及實驗方法符合福建中醫藥大學實驗動物倫理委員會要求（倫理批號FJTCM IACUC-2020048）。

1.2 主要試劑 MMP-13一抗（Proteintech，批號00089106）；Caspase-3一抗（Proteintech，批號00092560）；CollagenⅡ（Proteintech，批號00124977）；GAPDH兔抗（Proteintech，批號00098110）；qPCR反應試劑盒（Vazyme，批號7E410L0）；PCR引物設計與合成（福州尚亞生物）。

1.3 主要儀器 DNA擴增儀（PE，型號9600）；凝膠成像系統（Bio-RAD，型號GELDOC2000）；CO2恒溫培養箱（上海一恒科技，型號BB16/BB5060）；倒置相差顯微鏡（OLYMPUS，型號IX70）。

2 方 法

2.1 狗脊多糖的制備 狗脊多糖制備與濃度使用參照本課題組前期實驗［7］。稱取狗脊藥材50 g，依次經粉碎與篩檢、脫脂，重復提取2次（均為10倍體積蒸餾水·次-1/（2 h）-1，收集提取液2次，抽濾減壓，濃縮體積至100 mL；加入無水乙醇沉淀過夜，離心機以1000 r·min-1離心20 min，離心半徑10 cm；將分離出的沉淀再進行凍干，粗多糖浸泡后再溶于蒸餾水（200 g·L-1），采用Sevag法除蛋白質，放于超低溫冰箱保存。

2.2 軟骨細胞的分離培養、造模 15只C57BL/6小鼠經異氟烷（體積分數為5%）麻醉后脫頸處死，逐層解剖至終板軟骨組織層，分離并收集軟骨組織，后依次經PBS洗凈、修塊、胰蛋白酶（質量分數為0.25%）消化、PBS再漂洗、Ⅱ型膠原酶溶液（質量分數為0.2%）消化等操作，將含有終板軟骨細胞的懸液接種于培養皿中，轉移至培養箱中孵化培養、傳代［7］。IL-1β（10 ng·mL-1）誘導12 h制備軟骨細胞衰老模型［8］。

2.3 Real-time PCR檢測各組軟骨細胞中lncRNA NEAT1、p53、p21相對表達水平 將培養好的軟骨細胞分為空白對照組，模型對照組和狗脊多糖低、中、高劑量組。狗脊多糖各劑量組細胞在加入10 ng·mL-1 IL-1β干預12 h后，分別更換100，200，400 μg·mL-1 狗脊多糖繼續培養48 h［6］。提取各組軟骨細胞總RNA（Trizol法），逆轉錄成cDNA，待Real-time PCR反應（反應條件為95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s持續40個循環；熔解曲線設置為65～95 ℃，梯度升溫，每5秒升高0.5 ℃）完成后，對各組基因表達結果采用2-ΔΔct法分析。Real-time PCR相關引物見表1。

2.4 Western blot檢測各組軟骨細胞的MMP-13、CollagenⅡ、Caspase-3蛋白含量 待狗脊多糖干預后，提取總蛋白，依次經BCA定量分析、配制分離膠和濃縮膠、上樣、電泳、轉膜、封閉，孵育一抗、二抗后進行顯影、成像，分析數據。

2.5 流式細胞術檢測狗脊多糖干預后軟骨細胞中凋亡率情況 采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測。用胰酶（無EDTA）消化收集軟骨細胞，嚴格按照試劑盒（Annexin-Ⅴ-FITC/PI）說明書操作，于流式管加入100 μL Binding buffer（1×），將FITC和PI各5 μL混勻（避光反應15 min），再加入400 μL Binding buffer（1×）充分混勻。

2.6 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。計量資料以表示，采用t檢驗與單因素方差分析；計數資料采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 各組椎間盤軟骨細胞中lncRNA NEAT1、p53、p21 mRNA水平比較 Real-time PCR結果顯示，與模型對照組比較，狗脊多糖各劑量組lncRNA NEAT1、p53、p21水平顯著降低（P < 0.05）。見表2。

3.2 各組軟骨細胞中MMP-13、CollagenⅡ、Caspase-3蛋白表達比較 Western blot結果顯示，狗脊多糖作用于IL-1β誘導軟骨細胞后，可改善MMP-13、CollagenⅡ、Caspase-3蛋白含量表達。與模型對照組比較，狗脊多糖各劑量組的MMP-13、Caspase-3蛋白含量表達顯著降低，而CollagenⅡ顯著增高（P < 0.05）。見圖1、表3。

3.3 各組椎間盤軟骨細胞凋亡率比較 采用流式細胞術檢測細胞凋亡率。與空白對照組比較，模型對照組軟骨細胞凋亡率顯著增高（P < 0.05）；與模型對照組比較，狗脊多糖各劑量組軟骨細胞凋亡率顯著降低（P < 0.05）。見圖2、表4。

4 討 論

脊柱關節處椎間盤退變屬中醫學“痹證”范疇，即其病位在“肝腎”，然病在“筋骨”。隨著肝腎日漸虧虛，引起筋骨失養、腠理空虛，正氣不足以驅逐外邪，故風寒濕邪滯留關節而發病。因此，補腎柔肝、除痹消痛是其重要治則［9］。中藥狗脊始載于《神農本草經》，其性溫，味苦甘，入肝腎經，具有補肝腎、壯筋骨之效，切合痹證的治療病機，是臨床用于治療脊柱關節疾病的常用藥物之一［10］。狗脊多糖是中藥狗脊的重要活性物質成分。既往研究證實，狗脊多糖可促進軟骨細胞增殖，抑制氧化應激及軟骨細胞凋亡［11-13］。

近年來，大量證據表明，骨關節疾病的發生、發展與相關衰老細胞數量的增加密切相關［14］。一旦終板軟骨細胞經異常因素誘導發生衰老，其細胞合成蛋白質能力減弱，導致軟骨細胞外基質穩態失衡，造成軟骨終板結構紊亂，進而加劇脊柱關節退變［15］。另有研究發現，衰老相關分泌表型（MMPs等）表達異常加劇了終板軟骨細胞衰老［16］。Ⅱ型膠原作為構成細胞外基質中膠原蛋白成分的主要物質，一旦發生異常降解，可引起軟骨的抗壓與彈性功能下降［17］。MMP-13作為降解Ⅱ型膠原的關鍵酶類之一，可進一步加重軟骨退變與衰老［18］。已有研究證實，IL-1β（10 ng·mL-1）可誘導終板軟骨細胞發生衰老，而衰老的終板軟骨細胞中相關衰老標志物p53、p21蛋白呈現表達異常增高狀態［8］。

本研究結果亦發現，10 ng·mL-1 IL-1β誘導終板軟骨細胞后，其p53、p21水平及MMP-13、Caspase-3蛋白含量顯著增高，而Collagen Ⅱ含量顯著降低。經狗脊多糖干預后，可顯著降低IL-1β誘導的軟骨細胞中p21、p53基因水平，并可改善MMP-13、Collagen Ⅱ、Caspase-3蛋白表達，并降低軟骨細胞凋亡率。究其原因，狗脊多糖的作用機制可能與調控lncRNA NEAT1密切相關。lncRNA NEAT1已被證實在退變軟骨中上調表達，并通過促進軟骨細胞凋亡加劇軟骨退行性變［19］。此外，lncRNA NEAT1的異常表達與衰老相關信號分子p53的轉錄調控密切相關［20］。本研究結果表明，經IL-1β誘導的軟骨細胞中lncRNA NEAT1水平增高，與p53變化具有一致性，進而提示lncRNA NEAT1可能參與了對終板軟骨細胞衰老的調控；經狗脊多糖干預后，lncRNA NEAT1水平顯著降低。

綜上所述，狗脊多糖可通過影響p53、p21、MMP-13、CollagenⅡ、Caspase-3表達，降低軟骨細胞凋亡率，進而延緩椎間盤終板軟骨細胞衰老，其作用機制與調控lncRNA NEAT1有關。然而，本研究當前仍存在不足，例如狗脊多糖調控何種與lncRNA NEAT1相關的競爭性內源RNA途徑發揮延緩軟骨衰老的深層次作用機制仍需做進一步探討。

參考文獻

［1］ 朱超，阮狄克.椎間盤退變機制研究進展［J］.中國骨與關節雜志，2022，11（9）：700-706.

［2］ 張艷琳，黃國付，鄒璟，等.終板軟骨細胞衰老在腰椎間盤退變中的研究進展［J］.醫學研究雜志，2022，51（7）：173-176，134.

［3］ HERRANZ N，GIL J.Mechanisms and functions of cellular senescence［J］.J Clin Invest，2018，28（4）：1238-1246.

［4］ BUCKWALTER JA.Aging and degeneration of the human intervertebral disc［J］.Spine，1995，20（11）：1307-1314．

［5］ LIU F，LIU X，YANG Y，et al.NEAT1/miR-193a-3p/SOX5 axis regulates cartilage matrix degradation in human osteoarthritis［J］.Cell Biol Int，2020，44（4）：947-957.

［6］ 付長龍，梅陽陽，李民，等.基于Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信號通路探究狗脊多糖延緩大鼠椎間盤軟骨細胞退變［J］.中華中醫藥雜志，2019，34（7）：3311-3314.

［7］ 付長龍，梅陽陽，金靈璐，等.狗脊多糖調控lncRNA GAS5維持軟骨細胞外基質穩態的機制［J］.中華中醫藥雜志，2022，37（12）：7379-7383.

［8］ 周年，胡偵明，林鑫，等.SIRT1去乙?；揎梡53抑制IL-1β介導的軟骨終板細胞衰老［J］.第三軍醫大學學報，2018，40（22）：2040-2046.

［9］ 苑珍珍，楊召，許海委.中藥抑制椎間盤退變的分子機制研究［J］.中國矯形外科雜志，2022，30（1）：44-47.

［10］ 付長龍，梅陽陽，李民，等.狗脊多糖對硝普鈉誘導退變大鼠軟骨細胞氧自由基影響的研究［J］.風濕病與關節炎，2018，7（6）：5-9，14.

［11］ 孫群周.狗脊多糖通過miR-181c調控IL-1β介導的骨關節炎軟骨細胞增殖和凋亡［J］.中國老年學雜志，2021，41（11）：2398-2402.

［12］ HUANG D，HOU X，ZHANG D，et al.Two novel polysaccharides from rhizomes of Cibotium barometz promote bone formation via activating the BMP2/SMAD1 signaling pathway in MC3T3-E1 cells［J］.Carbohydr Polym，2020，231（231）：115732-115746.

［13］ FU C，ZHENG C，LIN J，et al.Cibotium barometz polysaccharides stimulate chondrocyte proliferation in vitro by promoting G1/S cell cycle transition［J］.Mol Med Rep，2017，15（5）：3027-3034.

［14］ 張廣智，武作龍，賀學崗，等.細胞衰老與椎間盤退變的相關性研究進展［J］.生命科學研究，2021，25（1）：58-63，94.

［15］ 徐偉，廖冬發，王娟，等.細胞衰老在骨關節炎中作用的研究進展［J］.中國矯形外科雜志，2022，30（15）：1386-1390.

［16］ 趙繼榮，楊正漢，馬俊飛，等.中醫藥干預基質金屬蛋白酶表達治療椎間盤退變研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志，2023，29（5）：272-282.

［17］ KUMAVAT R，KUMAR V，MALHOTRA R，et al.Biomarkers of joint damage in osteoarthritis：current status and future directions［J］.Mediators Inflamm，2021（9）：1-15.

［18］ HU Q，ECKER M.Overview of MMP-13 as a promising target for the treatment of osteoarthritis［J］.Int J Mol Sci，2021，22（4）：1742-1762.

［19］ FU C，QIU Z，HUANG Y，et al.Achyranthes bidentata polysaccharides alleviate endoplasmic reticulum stress in osteoarthritis via lncRNA NEAT1/miR-377-3p pathway［J］.Biomed Pharmacother，2022，154（1）：113551-113564.

［20］ MA T，LI H，LIU H，et al.Neat1 promotes acute kidney injury to chronic kidney disease by facilitating tubular epithelial cells apoptosis via sequestering miR-129-

5p［J］.Mol Ther，2022，30（10）：3313-3332.

收稿日期：2023-10-08；修回日期：2023-11-15