胰島素生產工藝及車間設計

王小明，程翔

（中國醫藥集團聯合工程有限公司，武漢 430077）

1 胰島素發展概述

胰島素是由胰臟內的胰島β細胞受內源性或外源性物質如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質激素。胰島素是機體內唯一降低血糖的激素，同時促進糖原、脂肪、蛋白質合成。外源性胰島素主要用來治療糖尿病。胰島素自發現、應用以來，已走過百年征程。

20 世紀20 年代至60 年代，從動物胰腺中提取胰島素被廣泛開發，開啟了動物源第一代胰島素。因為動物胰島素的生物結構與人胰島素存在一定的差別，注射體內后可能產生免疫反應，使得胰島素的降糖功效下降，還有少數患者出現皮膚過敏等[1]。

20 世紀80 年代，丹麥知名制藥企業諾和諾德公司率先實現了通過基因工程技術規?；a人胰島素，標志著第二代胰島素（重組人胰島素）時代的到來。重組人胰島素的結構與人胰島素完全相同，注射后全身免疫反應和局部過敏反應的發生率較動物胰島素顯著減少，且降糖效率提高，是目前常用的皮下注射胰島素[1]。

20 世紀末至21 世紀初，利用基因工程技術通過對胰島素結構的修飾或改變其理化性質，使其更符合生理需要的胰島素被廣發開發。開啟了第三代胰島素即胰島素類似物的發展。臨床廣泛應用的胰島素類似物有賴脯胰島素、甘精胰島素、門冬胰島素、地特胰島素、德古胰島素等。

2 重組胰島素的蛋白質表達系統

利用基因工程技術規?；a胰島素或胰島素類似物，首先要選擇合適的蛋白質表達系統。目前被廣泛應用于大規模生產的蛋白質表達系統主要有兩種：大腸桿菌表達系統和畢赤酵母表達系統。

2.1 大腸桿菌表達系統

長期以來，大腸桿菌被用來作為宿主表達了多種蛋白，這是因為大腸桿菌具有若干優點，如遺傳背景和生化特性清楚、容易操作、生長迅速、營養需求簡單等。不過大腸桿菌表達系統也有若干缺點，如缺少蛋白翻譯后修飾和加工、表達蛋白以包涵體的形式存在，需要經過復雜的復性才能恢復構象和活性，純化過程復雜、表達量不高等[2]。

近幾年來，大腸桿菌表達系統在不斷的創新與優化，一些新型表達純化系統如IMPACT-TWIN[3]的出現，提供了一步親和純化重組蛋白的方法。該系統利用自含肽自剪切的原理減少了后續的純化步驟，使得純化方法更簡便。目前，已有制藥企業采用自主研發的創新型大腸桿菌表達系統生產新一代超長效胰高糖素樣肽類似物—司美格魯肽。

2.2 畢赤酵母表達系統

畢赤酵母表達系統是一種表達外源蛋白的真核表達系統。它既具有原核表達系統繁殖快、操作簡單的優點，同時又能對表達的目的蛋白進行正確加工、折疊及適度糖基化[4]。而且該系統分泌表達的雜質蛋白較少，易于進行分離純化，因此越來越廣泛的應用于重組蛋白的表達。但畢赤酵母表達不同的外源蛋白的表達水平相差很大，再者發酵周期長，易污染、利用易燃的甲醇作為誘導物，表達產物的衛生安全性需要考慮。

在畢赤酵母表達系統中，不同目的蛋白的表達條件各不相同，因此研究者門常常需要通過優化表達條件來提高目的蛋白的表達量。國內已有多家制藥企業使用畢赤酵母表達系統生產超長效胰島素—德古胰島素。

3 胰島素原料藥生產工藝

利用基因工程和蛋白質工程技術制備胰島素原料藥（不包括制劑工藝），可概括為基因重組、蛋白表達和分離純化三大過程。具體來說包含以下步驟：

（1）從人類的DNA 中提取胰島素基因，使用限制性內切酶將目的基因從原DNA 中分離出來；

（2）從畢赤酵母（或大腸桿菌）的細胞質中提取質粒，質粒為環狀DNA；

（3）先利用同種限制性內切酶將質粒切開，再使用DNA 連接酶將目的基因與質?！翱p合”，重組成一個能表達胰島素的DNA 質粒；

（4）將重組后的質粒植入畢赤酵母細胞（或大腸桿菌）；

（5）從菌種庫中取出基因重組后的菌種進行復蘇和擴增；

（6）在種子罐中進一步擴大培養，對數生長期時轉入發酵罐培養；

（7）對發酵液進行固液分離，回收目標蛋白；

（8）通過多步層析法，配合酶切洗滌修飾等工藝過程純化目標蛋白，純化工藝過程中需添加甲類試 劑。

（9）對產品進行凍干和包裝。

圖1 以畢赤酵母表達系統為例，展示了胰島素原料藥生產的主要工藝過程及其常用潔凈級別。事實上，無論是何種表達系統，其基因重組的過程是類似的，區別在于發酵液的分離純化工藝不同。

圖1 胰島素原料藥生產工藝簡圖Fig.1 Schematic diagram of the process of insulin API

對畢赤酵母表達系統，目標蛋白存在于發酵液上清液中，離心實現固液分離，收取上清液，進行后續的提純。層析過程需要使用大量的緩沖液，其中部分層析過程會使用到甲類試劑，緩沖液及甲類試劑的種類和數量根據目標蛋白的不同而不同。

對大腸桿菌表達系統，目標蛋白存在于包涵體內，分離工藝更為復雜。首先需要離心收取包涵體，然后對包涵體進行破碎、均質、洗滌溶解，才能獲得包含目標蛋白的液體，進行下一步的純化。純化過程同樣需要大量的緩沖液和部分甲類試劑。

4 胰島素原料藥生產車間設計

大規模生產胰島素原料藥，重點在于控制發酵培養和分離純化工藝。胰島素原料藥生產車間的設計，包含從種子擴增至純化凍干的工藝及其過程中所需要的緩沖液和輔助系統的設計。

胰島素原料藥屬于非無菌原料藥，《藥品生產質量管理規范》（2010 年修訂）附錄2 第二章第三條規定“非無菌原料藥精制、干燥、粉碎、包裝等生產操作的暴露環境應當按照D 級潔凈區的要求設置[5]”?？梢?，GMP 對于與非無菌原料藥直接接觸的工藝過程最低要求為D 級潔凈區。然而，由于胰島素產品本質屬于生物制品，最終的胰島素注射劑屬于無菌制劑，根據《藥品生產質量管理規范》（2010 年修訂）附錄1 第十三條C 級潔凈區的操作示例“灌裝前可除菌過濾的藥液或產品的配制[5]”，胰島素注射劑灌裝前的過濾和配制過程應設計在C級潔凈環境。因此，根據經驗，為了保障胰島素原料藥產品質量，精純工藝通常設計在C 級潔凈區。

4.1 工藝功能間設計

平面方案布局時，功能間的設計要綜合考慮工藝流程、防爆需求、設備操作習慣及參觀需求。通常按照工藝過程的先后順序確定功能間的位置關系，例如采用直線型布局或者環形布局。同時要確保防爆間有足夠大的卸爆面積。頂層防爆間可以采用頂卸爆的方式，非頂層防爆間通常采用側卸爆的方式，因此非頂層甲類房間一般靠外墻布置。

根據已知的胰島素原料藥生產工藝，簡要介紹各大功能間的作用和設計要求。

（1）種子庫

使用超低溫冰箱或液氮罐，儲存生產菌種，以備放大培養。種子庫設計在控制區，且靠近種子擴增間布置為宜。

（2）種子擴增間

在生物安全柜內，對從種子庫中取出的菌種進行復蘇，然后利用搖床培養實現種子擴增。種子擴增是實現放大生產的關鍵步驟，根據經驗通常設計為C級潔凈環境。

（3）發酵間

通過種子罐—發酵罐逐級放大培養。培養過程中需要添加多種培養基，因此發酵系統通常配有補料罐。背景環境為D 級。

發酵間排水應作為生物廢水進行收集滅活處理。發酵尾氣含有二氧化碳、氮氣和揮發性氨氣，需要經過尾氣吸收裝置處理。

（4）離心收獲間。

與發酵間共用一個D 級區域，使用蝶式離心機對發酵液進行固液分離。排水應作為生物廢水進行收集滅活處理。

如果是酵母發酵，那么離心收取上清液；如果使用大腸桿菌發酵，那么離心收取的是下層包涵體，還需利用均質機對包涵體進行多次破碎均質，并經過洗滌溶解才能收取含目標蛋白的溶液。

（5）酶切反應間

酶切是將胰蛋白酶或其他酶制劑加入到胰島素前體溶液進行酶切轉化反應，以恢復人胰島素分子結構和活性。大腸桿菌表達的人胰島素表現為單鏈或胰島素原，因為形成包涵體，發酵后會變性和重折疊[6]。因此，對于大腸桿菌表達系統，酶切過程通常在層析之前進行，與收獲間共用D 級區域。

酵母能夠表達胰島素單體或是二聚體，通過二硫鍵的正確配對形成正確折疊的產物，后經過酶切轉化成人胰島素[6]。例如，利用巴斯德畢赤酵母表達系統獲得的胰島素原和胰島素類似物在純化后需要經過酶切去除C 肽，方能成為有功能的胰島素[6]。因此，對于畢赤酵母表達系統，酶切通常于第一步層析之后進行，在平面布局中，酶切間則位于下游純化區域。

（6）純化間

胰島素的純化工藝復雜，通常需進行三到四步層析和其他的沉淀洗滌修飾過程。根據具體工藝工程，可分為粗純和精純兩個區域。粗純區的背景環境為D 級，精純區的背景環境通常為C 級。

不同胰島素產品的純化過程可能不同，同一產品的不同生產廠家工藝也不一定相同。但是，根據已有的項目經驗，無論是哪一種產品工藝，胰島素的純化過程中都需要使用大量甲類試劑，對防爆區面積有較大的需求，設計不但要滿足規范對防爆面積的要求，還要滿足工藝需求。因此，純化間的數量和設計，需要具體情況具體分析。

以某企業胰島素類似物生產車間為例，業主提供的純化過程包含四步層析以及修飾縮合工藝，如圖2 所示。本車間屬丙類廠房，共兩層，單層建筑面積5 200 m2，根據工藝過程和設備布置情況，防爆區面積需求約700 m2，遠超出規范要求。

圖2 某胰島素類似物純化工藝Fig.2 The purification process of an insulin analogue

通過與業主深入討論工藝過程，得知高壓層析出料中甲類試劑含量極低無需防爆，且后續的離心洗滌過程不涉及甲類試劑，因此我們將高壓層析與離心過程分設在兩個功能間，以減少防爆區面積，離心洗滌間位于非防爆區。同時將第三、四步層析過程合并在同一個功能間內以節省面積。

因此，最終的純化過程共設計為低壓層析間、防爆高壓層析間一、離心洗滌間、防爆修飾縮合間、防爆高壓層析間二、離心間等六個功能間，圖3 顯示了改造之后的工藝步驟，修飾縮合及其后續工藝定義為精純。防爆間分設在兩層，每層防爆區控制在250 m2，滿足工藝需求和規范要求。

圖3 改造后的純化工藝步驟Fig.3 The reorganizing purification process

（7）凍干間

純化后收獲的固體產物，添加注射用水溶解后，進凍干機凍干得成品原料藥。溶解及裝載過程位于C級區，凍干機置于非潔凈區的凍干機房。

（8）分裝間

凍干后的產品進行粉碎、分裝，為保護人員與產品，建議粉碎及分裝過程在隔離器中進行。同時分裝間最好有氣鎖保護。

4.2 輔助功能間設計

胰島素原料藥生產車間涉及的輔助功能間包括：培養基配制、緩沖液配制、緩沖液暫存、器具清洗滅菌、工衣清洗滅菌、廢棄物滅活、CIP 工作站、物料暫存等。

（1）培養基配制間

為上游發酵準備培養基，通常緊鄰發酵間布置，也可以與發酵間共用一個D 級走廊。

（2）緩沖液配制&暫存間

為純化工藝過程配制緩沖液，通常單獨設計一個緩沖液配制區，靠近使用點，與純化區潔凈級別相同。因緩沖液種類多、用量大，配制罐和暫存罐較多，通常設計為兩個貼鄰的房間，即緩沖液配制間和緩沖液暫存間。緩沖液暫存間設計在非潔凈區。

甲類試劑的配制需要設計獨立的防爆配液間，防爆配液暫存間應貼鄰防爆純化間設計，避免甲類物料管道穿越非防爆區。緩沖液配制區布局如圖4 所示。其中紅色范圍為防爆區。

圖4 緩沖液配制區布置示意圖Fig.4 The layout diagram of a buffer preparation area

（3）其他輔助功能間

潔凈區域內應設計配套的器具清洗間、滅菌間。工衣清洗滅菌可設計統一的洗衣中心。上游發酵區域廢棄物含有或粘有生物活性物質，需要設計滅活退出 間。

4.3 公用工程設計

醫藥廠房設計通常涉及以下公用工程房間：空調機房、冷凍站、空壓站、變配電室、發電機房、制水間、生物廢水滅活、蒸汽減壓、冷凝水回收、氣瓶間等。根據項目廠區情況和產品工藝需求的不同，當前生產車間需要設計的公用工程房間種類和數量也不盡相同。對于胰島素生產車間，重點說明以下幾點：

（1）非頂層的空調機房建議靠外墻布置，以便于空調系統取風。頂層空調機房可設置在使用區域上方。由于胰島素的生產過程中需要使用甲類試劑，車間包含防爆區，因此建議為防爆區設計單獨的防爆空調機房。

（2）胰島素的分離純化過程中，除了對離心機、換熱器等設備進行換熱降溫之外，還通常需要對中間品控溫至2～ 8°C 甚至更低，因此需要為其設計冷凍水系統和乙二醇系統。另外，通常凍干機設備對進水溫度的要求比較苛刻，如果已有冷凍水和乙二醇系統不能滿足其要求，則需要為凍干機單獨設計一套冷卻循環水系統。因此，如果廠區內沒有統一的動力中心，那么則需要在胰島素原料藥生產車間內設計冷凍站。

（3）無論使用大腸桿菌還是畢赤酵母表達蛋白，其發酵培養過程中均需使用大量的潔凈壓縮空氣，有些生產工藝還要消耗氧氣。另外，防爆區配液罐和工藝罐必須使用氮氣密封。所以，胰島素原料藥的生產需配備壓縮空氣制備系統、氮氣制備系統和氧氣制備系統（如需要）?？諌赫究赡茉趶S區的動力中心或者生產車間內。

（4）上游工藝過程排水含有活性生物，需收集滅活后方可排放。如果胰島素原料藥生產車間分多層布置，建議將發酵工藝置于二層及以上，生物廢水收集滅活裝置設計在一層，便于樓上的生物廢水利用重力作用自流進入廢水收集罐，然后泵至滅活罐。如果車間只有一層，那么生物廢水收集罐需要設計為埋地暫存罐，或者置于局部地下室中。

4.4 全車間布局示意圖

車間二層、一層布局示意圖見圖5～ 6。

圖5 車間二層布局示意圖Fig.5 The layout diagram of the second floor

圖6 車間一層布局示意圖Fig.6 The layout diagram of the first floor

5 結束語

利用基因工程技術生產胰島素或胰島素類似物，是目前市場上的主流工藝。其中，大腸桿菌和畢赤酵母蛋白質表達系統的應用最為廣泛。在進行胰島素原料藥車間的設計時，首先要明確生產使用的是何種蛋白質表達系統，因為不同表達系統的分離工藝大不相同。其次，應與業主進行充分的溝通，根據其生產工藝特點，確定工藝功能間的數量和空氣潔凈度級別，重點關注防爆功能間的設計。最后，完善輔助功能間和公用工程系統設計，保障工藝需求。