基于Wnt/β-Catenin信號通路探討吳門骨密葆方含藥血清促進間充質干細胞成骨分化的效應機制

梁國強，李宇衛，沈曉峰，尤君怡，張國棟，華永慶

（1.南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院中心實驗室，江蘇 蘇州 215009；2.南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院骨傷科，江蘇 蘇州 215009；3.南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院康復科，江蘇 蘇州 215009；4.南京中醫藥大學藥學院，南京 210023）

現代中醫學把骨質疏松歸為“骨痿”證的討論范疇。依據其病位在骨而主要病機為“髓枯骨痿”，基于中醫“腎主骨”的理論，骨病專家形成共識的“補腎壯骨”的治則[1]。中醫學強調的“髓充則骨養”與骨髓間充質干細胞具有多向分化潛能有機相映[2]。目前，骨病研究者[3]認為，在調控骨髓間充質干細胞分化以及骨形成中起著積極的作用的Wnt/β-Catenin信號通路是骨質疏松治療的重要潛在靶點之一。在團隊前期研究表明，臨床有效抗骨質疏松癥的吳門骨密葆方抑制Wnt/β-連環蛋白（β-Catenin）信號通路[4]，同時激活成骨細胞Runt相關轉錄因子2（Recombinant Runt Related Transcription Factor 2，RUNX2）mRNA，促進骨形成[5]。分泌型蛋白Dickkopf-1（DKK-1）被確認為Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑，其與Wnt蛋白競爭性地直接與Wnt共受體LRP5/6結合，或者間接與其另外兩類受體Kremen和LRP結合而形成三聚體，從而抑制Wnt蛋白活性[6]。本研究旨在探討吳門骨密葆方治療骨質疏松的分子生物學機制與Wnt/β-catenin信號通路的相關性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和細胞

選用6周齡SPF級SD雄性大鼠25只，體質量280～300 g。制備正常血清及吳門骨密葆方含藥血清，購于昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司，飼養于蘇州大學醫學實驗動物中心SPF級實驗室，許可證號分別為SCXK（蘇）2018-0006和SYXK（蘇）2021-0065。SD大鼠骨髓間充質干細胞由深圳市豪地華拓生物科技有限公司代購（進口貨號：HTX2393），將此細胞置于37℃、體積分數5%的CO2培養箱內常規培養。每24 h更換液1次，待細胞長至近鋪滿細胞培養瓶底時，應用0.25%的胰酶消化，按1:3（接種濃度3×104·mL-1）傳至第3代應用于實驗。實驗由蘇州市中醫醫院動物倫理委員會批準（動物倫理批號：2022052），于2023年1月—2023年6月在南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫院中心實驗室和蘇州大學實驗動物中心完成。

1.2 實驗藥物

吳門骨密葆方包括生黃芪20 g，補骨脂10 g，蛇床子10 g，何首烏15 g，肉蓯蓉10 g，懷牛膝10 g，莪術10 g，海螵蛸30 g。藥材購買于蘇州市天靈中藥飲片有限公司，由蘇州市中醫醫院藥學部供應。

1.3 實驗試劑

α-MEM液體培養基、胎牛血清（GIBCO公司）；胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）、青鏈霉素混合液（100′）（Solarbio公司）；間充質干細胞成骨誘導分化培養基（OBM：含10 mM β-甘油磷酸鈉水合物和50 μg·mL-1抗壞血酸）、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司）；CCK-8細胞增殖及毒性檢測試劑盒（SAB公司）；堿性磷酸酶試劑盒（微板法，南京建成生物工程研究所）；RIPA組織細胞快速裂解液（北京索萊寶公司）；蛋白預染Marker（Fermentas公司）；BCA蛋白定量試劑盒（Thermo公司）；NC膜和化學發光檢測試劑盒（Millipore公司）；Wnt信號蛋白家族3alpha（Wnt3a）（貨號：ab219412）、β-actin（貨號：ab8226）抗體（Abcam公司）；β-Catenin（貨號：#8480）抗體（美國CST公司）；糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）（貨號：bs-0023R）、破骨細胞抑制因子[（osteoclastogenesis inhibitory factor，OCIF; 又稱護骨素（osteoprotegerin，OPG）]（貨號：bs-20625R）和核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）（貨號：bs-20647R）抗體（Bioss公司）；羊抗兔HRP（貨號：A0208）二抗（碧云天公司）。其他試劑均為市售分析純。

1.4 實驗儀器

TDZ4-WS離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；DNM-9602酶標儀（北京普朗新技術有限公司）；Forma 3111 CO2恒溫培養箱（Thermo公司）；CX41正置顯微鏡（OLYMPUS公司）；Mini protean 3 cell電泳儀（BIO-RAD公司）；DHG-9023A恒溫烘箱（上海恒一科學儀器有限公司）；TE77XP電轉儀（HOEFER公司）。

1.5 吳門骨密葆方含藥血清制備

選取25只大鼠隨機分為正常組（n= 5）和吳門骨密葆方低、高劑量組（n= 10），空白組以灌胃生理鹽水（10 mL·kg-1）；參考文獻將吳門骨密葆方低、高劑量組分別給予低劑量（根據人與動物體表面積換算為：10 g生藥/kg）、高劑量（換算為人正常服用劑量2倍：20 g生藥/kg）吳門骨密葆方湯劑灌胃7 d[7]。最后灌胃給藥后1 h進行麻醉，采用腹主動脈抽血抽取各組大鼠血液，離心（3 000 r·min-1、30 min）后取上層血清，進行滅活（56℃、30 min）后，采用0.22 μm濾膜對同組混勻血清過濾滅菌，于-20℃冰箱保存以備實驗應用。

1.6 實驗細胞分組

取3代培養的大鼠骨髓間充質干細胞，按參考文獻[8]隨機分為7組。1）A組：正常血清組（基礎培養基+10%正常大鼠血清）；2）B組：經典誘導組（OBM+10%正常大鼠血清）；3）C組：吳門骨密葆方低計量組（基礎培養基+10%對應血清）；4）D組：吳門骨密葆方高劑量組（基礎培養基+10%對應血清）；5）E組：DKK-1抑制劑組（基礎培養基+10%正常大鼠血清+0.1 ng·mL-1DKK-1）；6）F組：吳門骨密葆方低劑量+抑制劑組（基礎培養基+10%對應血清+0.1 ng·mL-1DKK-1）；7）G組：吳門骨密葆方高劑量+抑制劑組（基礎培養基+10%對應血清+0.1 ng·mL-1DKK-1）。干預7 d，每3 d更換對應液1次，其中DKK-1抑制劑于第3 d加入干預。

1.7 CCK-8法檢測細胞增殖活性

取3代大鼠骨髓間充質干細胞，以每毫升5×103個的密度接種于含10%FBS、1.0%青霉素和鏈霉素的α-MEM培養基中。將細胞置于37℃、5% CO2培養箱中培養。當細胞達到80%融合時，按以上分組有機干預，換用100 μL含10%體積的各組血清的相應培養液（n= 5），培養7 d后，加入10 μL CCK-8溶液，在培養箱內孵育1 h，設定450 nm波長，采用酶標儀測定吸光度值。

1.8 ALP染色及ALP活性檢測

將3代骨髓間充質干細胞以5×105個/孔接種于6孔板，按以上分組進行成骨誘導分化，每3 d換液體1次，誘導7 d后，細胞采用ALP染色試劑盒進行染色，倒置顯微鏡下觀察拍照分析。各組細胞培養液離心（1 500 r·min-1，10 min）收集上清液，嚴格根據試劑盒說明書，每空分別加入基質液和緩沖液各50 μL和樣品30 μL，充分混勻、孵育（37℃，15 min）后加入150 μL顯色劑、振搖混勻，設定450 nm波長，采用酶標儀同步檢測檢測實驗孔和空白（雙蒸水）孔、標準孔的吸光度值，得到各組ALP活性原始實驗數據后進行統計分析。

1.9 Western blot 檢測各組細胞中相關蛋白表達

取3代骨髓間充質干細胞，以5×105個/孔接種于6孔板，按以上分組進行成骨誘導分化，每3 d換液體1次，誘導7 d，Wnt3α、β-Catenin、GSK3β、OPG、RANKL蛋白表達差異采用Western blot檢測。收集在含PMSF的RIPA裂解液中目標總蛋白，以BCA法確定蛋白濃度。取30 mg蛋白進行SDSPAGE電泳、轉膜、封閉；一抗[Wnt3α（1:1 000）、β-Catenin（1:1 000）、GSK3β（1:500）、OPG（1:1 000）、RANKL（1:500）、β-actin（1:1 500）]孵育過夜，加HRP二抗（1:2 000）孵育60 min，進行化學發光檢測和凝膠成像系統掃描，應用Image軟件對結果圖像進行分析，蛋白相對表達量=目標蛋白灰度值/內參β-actin灰度值。

1.10 統計學方法

所得實驗數據，應用 Graphpad prism 8 軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，符合正態分布的情況下的數據，采用單因素方差分析進行組間比較；對于不符合正態分布數據，進行非參數檢驗分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 吳門骨密葆方含藥血清對間充質干細胞增殖的影響

見表1。

表1 吳門骨密葆方含藥血清對間充質干細胞增殖的影響（±s，n= 5）

表1 吳門骨密葆方含藥血清對間充質干細胞增殖的影響（±s，n= 5）

注：與A組比較，# P＜0.05；與C組比較，△P＜0.05；與D組比較，▲P＜0.05

組別細胞增殖（OD值）A組0.515±0.045 B組0.546±0.052#C組0.548±0.049#D組0.541±0.046#E組0.506±0.051 F組0.514±0.046△G組0.523±0.044▲

2.2 吳門骨密葆方含藥血清對骨髓間充質干細胞堿性磷酸酶染色及活性的影響

ALP染色結果顯示：經典誘導組與各劑量吳門骨密葆方含藥血清干預7 d后，與正常血清組相比，各組ALP染色程度增強，且酶活力以劑量依賴式增強。與抑制劑組比較，加入DKK-1的各含藥血清組ALP染色程度均增強，與同劑量吳門骨密葆方含藥血清組比較，加入DKK-1的各含藥血清組ALP染色程度均減弱。見圖1，見表2。

圖1 吳門骨密葆方含藥血清對骨髓間充質干細胞ALP染色的影響（×400）

表2 吳門骨密葆方含藥血清對骨髓間充質干細胞ALP活性的影響（±s，n= 5）

表2 吳門骨密葆方含藥血清對骨髓間充質干細胞ALP活性的影響（±s，n= 5）

注：與A組比較，# P＜0.05；與B組比較，△P＜0.05；與C組比較，▲P＜0.05；與D組比較，□P＜0.05；與E組比較，■P＜0.05

組別ALP活性（金氏單位/gprot）A組1.421±0.136 B組2.704±0.175#C組1.971±0.112#△D組2.089±0.173△E組1.411±0.121 F組1.468±0.110▲G組1.515±0.176#□■

2.3 吳門骨密葆方含藥血清對骨髓間充質干細胞Wnt/β-Catenin信號通路相關蛋白表達的影響

見圖2、圖3。

圖2 各組Wnt3α、β-Catenin、GSK3β、OPG和RANKL蛋白條帶圖

圖3 各組Wnt3α、β-Catenin、GSK3β、OPG和RANKL蛋白相對表達量（±s，n= 5）

3 討論

補腎中藥具有調節機體內激素水平和提高機體免疫功能，以及刺激骨髓間充質干細胞增殖、促進成骨分化和成熟的功效，已被充分的現代中藥藥理學研究[9]證明。本研究的CCK-8結果顯示，吳門骨密葆方含藥血清具有明顯的促進骨髓間充質干細胞增殖的能力；同時ALP染色強度和活性檢測結果提示，吳門骨密葆方含藥血清能夠有效促進骨髓間充質干細胞成骨分化。

在本研究Western blot 檢測結果中發現，Wnt/β-catenin以及OPG/RANKL信號通路可能在吳門骨密葆方含藥血清促進骨髓間充質干細胞成骨分化中發揮了重要調控作用。DKK-1作為Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑，其可有效抑制骨髓間充質干細胞向成骨分化，并抑制成骨細胞分泌OPG，導致OPG水平降低，提高RANKL水平，使RANKL/OPG比例增加，促進破骨細胞分化[10]。本研究在吳門骨密葆方含藥血清中加入DKK-1干預后，結果顯示，吳門骨密葆方含藥血清增殖及成骨分化能力被明顯抑制。從而又進一步驗證了吳門骨密葆方含藥血清在促進骨髓間充質干細胞增殖及成骨分化中Wnt/β-catenin、OPG/RANKL信號通路發揮重要調控作用。