辛潤宣通法治療神經病理性疼痛細胞因子的調控機制

侯媛媛，閆詠梅

（陜西中醫藥大學附屬醫院，陜西 咸陽 712000）

神經病理性疼痛是由神經系統功能性異?；蚱髻|性損傷引發的常見疼痛類型，臨床多表現為慢性疼痛且多合并失眠、抑郁、焦慮等精神障礙，對患者日常生活影響較大[1-2]。目前臨床多通過抗驚厥、阿片類、抗抑郁藥物等對神經病理性疼痛進行治療，雖然上述藥物可暫時減輕疼痛，但對神經損傷無修復作用，且常引發神經順應性下降、神經脫髓鞘等副作用，故臨床應用具有局限性[3]。中醫在多種疼痛性疾病治療中均有應用，臨床經驗較為豐富且鎮痛效果較佳，而旋覆花湯為辛潤宣通法，具有滋潤陰血、宣通脈絡的作用，在背部疼痛、療帶狀皰疹后遺頑固性肋間神經痛等多種疼痛性疾病治療中均取得較好治療效果[4]?；诖?，本研究分析了辛潤宣通法對神經病理性疼痛細胞因子的調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取120只SPF級Wistar大鼠，體質量180～220 g，由江西浩然生物制藥有限公司提供，動物許可證號：SYXK（贛）2019-0007。所有大鼠在相對濕度、室溫分別為50%、23°C的無病原菌籠子中進行5 d適應性喂養，本試驗操作均參照動物試驗倫理要求的相關規定，且經我院倫理委員會批準同意（倫理編號：20210612）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與建模 大鼠適應性喂養5 d后按照隨機數字表法分為假手術組、模型組、旋覆花湯高劑量組、中劑量組及低劑量組、普瑞巴林組，每組各20只，假手術組正常喂養，剩余5組參照劉霞等[5]建立神經病理性疼痛模型，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后將坐骨神經起始處顯露，腓總神經、脛神經采用絲線結扎，將腓腸神經保留，以大鼠出現明顯舔足及抬足為建模成功。

1.2.2 藥物制備及給藥 取旋覆花、歸尾、茜草、桃仁、柏子仁各10 kg，加600 L水，煮沸后再煎沸60 min，后對藥物濾液進行過濾、收集，藥渣中再加水500 mL，煮沸后再煎沸60 min，再次收集濾液，將2次收集藥液合并，離心15 min（3 cm離心半徑，3 000 r·min-1轉速），后將離心處理濾液在60℃、-0.06MP壓力減壓下壓縮成32.5 L（生藥液濃度為1.54 g·mL-1），保存于4 ℃以下，旋覆花湯高劑量組、中劑量組、低劑量組分別給予10 g·kg-1、5 g·kg-1、2.5 g·kg-1旋覆花湯藥液，于術后1 d進行灌胃，每日1次，共15 d，普瑞巴林組在術后1 d給予15 mg·kg-1普瑞巴林藥液，每日1次，共15 d，假手術組及模型組同量0.9%氯化鈉溶液，每日1次，共15 d。

1.2.3 樣本采集 連續干預15 d后，麻醉后橫向切開術側臀股交界處，逐層分離肌肉、筋膜，暴露坐骨神經后，取1 cm坐骨神經，制成標本，-80 ℃保存。

1.3 指標檢測

1.3.1 病理學觀察 取保存待檢大鼠坐骨神經，經脫水、石蠟包埋處理后，做HE染色，光鏡下對坐骨神經病理形態變化進行分析。

1.3.2 行為學檢測 于用藥結束后麻醉處死前對大鼠括自發性疼痛評分、大鼠機械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold, MWT）、熱縮足反射潛伏期（thermal withdrawal latency, TWL）水平進行檢測。1）自發性疼痛評分檢測：將大鼠置于0.45 m×1.2 m×1.2 m的安靜格子中，對其自由活動、跛行程度、后肢使用情況進行觀察，后爪無畸形、運動正常為0分，后爪明顯畸形但運動正常為1分，有垂足現象，運動行為輕度異常為2分，術側后爪癱瘓，運動行為嚴重異常為3分；2）MWT水平檢測：將大鼠置于透明、安靜的有機玻璃中，溫度為23～25℃，適應30 min后通過Von Frey纖維絲對術側后肢足底外側進行刺激，共刺激3次，后對纖維絲刻大小進行記錄，即為MWT；3）TWL水平檢測：通過YLS-6B智能熱板儀對TWL水平進行檢測。

1.3.3 炎性因子、疼痛介質水平檢測 取保存待檢大鼠坐骨神經，充分碾碎，離心15 min（3 cm離心半徑，3 000 r·min-1轉速）對上清液進行提取，保存于-70℃冰箱中，各組大鼠中白細胞介素（interleukin, IL）-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor, TNF-α）、IL-10、β-內啡肽（β-end orphin, β-EP）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）、前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）水平通過酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）法進行檢測。

1.3.4 Toll樣受體4（Toll like Receptor 4, TLR4）、核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）mRNA表達量檢測 取保存待檢大鼠坐骨神經，TLR4、NFκB mRNA表達量通過實時熒光定量法進行鑒定，提取總RNA，坐骨神經中RNA逆轉錄為cDNA采用Takara逆轉錄試劑盒，Primer 5.0軟件設計引物序列后將PCR儀啟動。通過2-△△Ct方法計算出TLR4、NF-κB的mRNA表達量。

1.3.5 TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白相對表達量檢測 坐骨神經中的TLR4/NF-κB信號通路中的TLR4、NF-κB蛋白相對表達量通過Western Blot進行檢測，將加入適量（1:10）組織蛋白抽離液加入大鼠坐骨神經，充分碾碎，離心15 min（3 cm離心半徑，3 000 r·min-1轉速）提取上清液，做BCA蛋白定性檢測，將樣品上樣至8%SDS-PAGE凝膠上，經電泳后轉移至PVDF膜上，TBST稀釋的羊抗鼠TLR4、NF-κB（1:2 500）一抗在PBS封閉2 h后加入，后孵育過夜（4 ℃），洗膜3次，加入稀釋羊抗鼠二抗（1:10 000），溫室孵育1 h，做TBST洗膜3次，蛋白表達情況定量分析以GAPDH為內參照，重復試驗3次。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件包進行統計分析處理。計量資料采用均數±標準差（±s）描述，多組間比較采用方差齊性檢驗，2組間比較采用重復測量的方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組光鏡下病理切片對照

假手術組神經纖維軸索清晰、排列整齊，模型組神經纖維間質疏松、水腫，排列紊亂，普瑞巴林組、旋覆花湯低劑量組、旋覆花湯中劑量組旋神經纖維排序改善，間質水腫依舊存在，旋覆花湯高劑量組神經纖維排序基本恢復，水腫明顯減輕。見圖1。

圖1 各組光鏡下病理切片對照（HE染色，×400倍）

2.2 各組行為學比較

見表1。

表1 各組行為學比較（±s ，n= 20）

表1 各組行為學比較（±s ，n= 20）

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與普瑞巴林組比較，▲P＜0.05；與旋覆花湯低劑量組比較，□P＜0.05；與旋覆花湯中劑量組比較，■P＜0.05

組別自發性疼痛評分/分MWT/sTWL/s假手術組0.00±0.0036.79±4.0213.56±2.02模型組2.21±0.21#21.14±2.89# 6.01±0.72#普瑞巴林組1.72±0.20#△26.21±2.51#△ 9.14±1.03#△旋覆花湯低劑量組1.71±0.21#△26.30±2.52#△ 9.12±1.05#△旋覆花湯中劑量組1.69±0.23#△25.98±2.60#△ 9.20±1.01#△旋覆花湯高劑量組1.30±0.14#△▲□■32.11±3.52#△▲□■11.37±1.59#△▲□■

2.3 各組炎性因子水平比較

見表2。

表2 各組炎性因子水平比較（±s ，n = 20） pg·mL-1

表2 各組炎性因子水平比較（±s ，n = 20） pg·mL-1

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與普瑞巴林組比較，▲P＜0.05；與旋覆花湯低劑量組比較，□P＜0.05；與旋覆花湯中劑量組比較，■P＜0.05

組別IL-1βTNF-αIL-10假手術組11.36±1.5842.73±5.2620.03±3.56模型組26.37±3.01#80.69±10.34#10.25±1.51#普瑞巴林組20.52±2.56#△60.51±6.14#△14.07±2.01#△旋覆花湯低劑量組20.60±2.58#△59.63±6.20#△13.98±2.10#△旋覆花湯中劑量組20.61±2.61#△60.62±6.38#△14.12±2.03#△旋覆花湯高劑量組15.72±1.69#△▲□■50.27±5.69#△▲□■16.58±3.14#△▲□■

2.4 各組疼痛介質水平比較

見表3。

表3 各組疼痛介質水平比較（±s ，n = 20） ng·L-1

表3 各組疼痛介質水平比較（±s ，n = 20） ng·L-1

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與普瑞巴林組比較，▲P＜0.05；與旋覆花湯低劑量組比較，□P＜0.05；與旋覆花湯中劑量組比較，■P＜0.05

組別β-EP5-HTPGE2假手術組180.59±20.03102.60±13.65161.59±20.73模型組101.37±12.54#191.37±24.73#254.96±31.80#普瑞巴林組131.72±16.25#△150.43±16.01#△210.72±23.60#△旋覆花湯低劑量組132.80±16.24#△151.37±15.98#△211.80±23.41#△旋覆花湯中劑量組130.68±17.01#△149.37±16.11#△209.73±24.01#△旋覆花湯高劑量組154.83±18.37#△▲□■120.83±15.74#△▲□■180.44±21.03#△▲□■

2.5 各組TLR4、NF-κB mRNA表達量比較

見表4。

表4 各組TLR4、NF-κB mRNA表達量比較（±s ，n= 20）

表4 各組TLR4、NF-κB mRNA表達量比較（±s ，n= 20）

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與普瑞巴林組比較，▲P＜0.05；與旋覆花湯低劑量組比較，□P＜0.05；與旋覆花湯中劑量組比較，■P＜0.05

組別TLR4NF-κB假手術組1.00±0.011.00±0.01模型組2.56±0.33#2.63±0.37#普瑞巴林組2.01±0.21#△1.98±0.24#△旋覆花湯低劑量組1.99±0.23#△2.00±0.25#△旋覆花湯中劑量組2.03±0.20#△1.99±0.23#△旋覆花湯高劑量組1.42±0.15#△▲□■1.50±0.17#△▲□■

2.6 各組TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白相對表達量比較

見表5。

表5 各組TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白相對表達量比較（±s，n= 20）

表5 各組TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白相對表達量比較（±s，n= 20）

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與普瑞巴林組比較，▲P＜0.05；與旋覆花湯低劑量組比較，□P＜0.05；與旋覆花湯中劑量組比較，■P＜0.05

組別TLR4NF-κB假手術組1.00±0.011.00±0.01模型組2.23±0.24#2.30±0.36#普瑞巴林組1.80±0.19#△1.89±0.21#△旋覆花湯低劑量組1.82±0.20#△1.90±0.22#△旋覆花湯中劑量組1.79±0.21#△1.91±0.23#△旋覆花湯高劑量組1.32±0.14#△▲□■1.35±0.17#△▲□■

3 討論

中醫認為神經病理性疼痛屬“筋傷”“痹癥”范疇，其核心病機為經絡淤阻、氣血不暢[6]。旋覆花湯屬于辛潤宣通法，具有散氣節、利氣下行、通血脈等作用，其中旋覆花可疏肝通絡、化痰平喘、利尿消腫，歸尾具有調經止痛、補血活血的作用，茜草可祛淤通經、涼血活血，桃仁具有抗炎鎮痛、活血化瘀的作用，柏子仁可安心養神，以上諸藥合用可發揮清熱滌痰、活血化瘀之效[7]。本研究發現，神經病理性疼痛大鼠通過辛潤宣通法干預后炎癥反應減輕，疼痛介質水平改善，疼痛癥狀緩解，表明辛潤宣通法可有效減輕神經病理性疼痛大鼠疼痛情況，且呈劑量依賴。

神經病理性疼痛臨床癥狀以機械疼痛超敏、熱痛覺過敏、穩定及明顯自發性疼痛為主，中樞及外周機制均為神經病理性疼痛的發病機制，其中外周機制包括炎癥因子活化、異位放電，中樞機制包括中樞敏化、中樞去抑制等，而炎性因子釋放增多為神經病理性疼痛發病的主要原因[8]。神經病理性疼痛發生、發展期間膠質細胞被激活，進而轉化為“活化”狀態，使得神經損傷進一步加重，而活化的膠質細胞可釋放IL-1β、TNF-α等炎癥因子，其中IL-1β可由活化巨噬細胞以原蛋白形式表達，為疼痛信號傳導的主要因子，可造成初級感覺神經元神經纖維敏感，進而導致疼痛超敏；TNF-α可結合星形膠質細胞中腫瘤壞死因子受體1，對氨基末端激酶活化起到了促進作用，使得星形膠質細胞進一步激活，神經病理性疼痛加劇[9]。IL-10則是對TNF-α表達具有抑制作用的抗炎細胞因子，在疼痛發生、疼痛治療中發揮著重要作用，可發揮鎮痛作用[10]。研究[11]發現，疼痛介質分泌情況與神經病理性疼痛病情存在密切聯系，機體組織損傷后炎性因子大量釋放，使得疼痛刺激加劇，進而促進了疼痛介質釋放，β-EP是疼痛抑制性遞質，其表達水平與痛覺敏感性呈負相關；5-HT、PGE2均為疼痛因子，可降低疼痛閾值。本研究發現，神經病理性疼痛大鼠通過辛潤宣通法干預后自發性疼痛評分、IL-1β、TNF-α水平下降，MWT、TWL、IL-10水平上升，表明辛潤宣通法可減輕神經病理性疼痛大鼠炎癥反應，改善機械疼痛超敏、熱痛覺過敏、穩定及明顯自發性疼痛。

TLR4/NF-κB是與神經根性疼痛、膝骨關節炎、骨癌痛、盆腔炎等多種炎性、疼痛性疾病相關的信號通路[12-13]。TLR4是由小膠質細胞表達的Toll樣受體家族成員，在先天免疫激活、病原體識別中發揮著重要作用，為先天免疫激活的關鍵調節劑，激活后的TLR4可釋放多種增強神經元興奮性的調節劑及神經遞質，進而參與了炎癥反應調節、神經病理性疼痛加重及維持，而NF-κB可由TLR4激活，激活后的NF-κB可促進炎性細胞因子合成、分泌，且可啟動獲得性免疫應答，最終推動了神經病理性疼痛疾病進展[14]。旋覆花湯中的桃仁可抑制炎性反應，進而對TLR4/NF-κB信號通路起到了抑制作用，而茜草對血液循環具有促進作用，進而阻斷了疼痛神經傳導，抑制了致痛因子表達，促進了鎮痛物質釋放，本研究發現，神經病理性疼痛大鼠通過辛潤宣通法干預后TLR4、NF-κB表達量下降，提示辛潤宣通法可能通過調控TLR4/NF-κB信號通路而抑制炎性反應，減輕疼痛。