低酸泡菜發酵乳酸菌與酵母菌篩選及其共發酵研究

陳駿飛，唐 蓉，王 暉，劉畢琴，湯回花，李 宏，史 巧*

（1.云南省農業科學研究院 農產品加工研究所，云南 昆明 650223；2.云南農業大學 食品科學技術學院，云南 昆明 650201）

泡菜是中國傳統的發酵食品之一，是將蔬菜浸泡在鹽溶液中，然后經過乳酸發酵而成[1]。芥菜發酵后有一種特殊鮮味和香味，且含有天然的乳酸菌及其代謝產物，能促進胃、腸消化功能，幫助消化，增進食欲，深受廣大消費者喜愛[2-3]。我國發酵芥菜的工藝較復雜，大多工業化生產仍然是采用高鹽自然發酵，成品品質參差不齊，風味質量不穩定[4-5]。

芥菜發酵過程中微生物的種類和數量不斷變化，主要為乳酸菌、醋酸菌和酵母菌等[6]。發酵前期以腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、魏斯氏菌（Weissellasp.）等異型發酵乳酸菌為主，與同型乳酸菌相比，它們發酵產酸能力相對較弱，適用于低酸泡菜發酵[7]，且能將大量有機物分解產生CO2、甘露醇和乙醇等含酸較少的代謝產物，賦予泡菜清爽的味道，提升泡菜風味[8-9]。為了提高泡菜的感官品質，選擇合適的異型發酵乳酸菌啟動發酵是必要的。除此之外，酵母菌也是泡菜中常見的微生物類群，廣泛存在于蔬菜發酵階段，能產生醇類、酯類等風味物質，賦予泡菜獨特的醇香和酯香等香氣成分[6，10]。特定酵母菌在較酸的環境下可更大程度的利用可發酵糖，并能代謝利用乳酸，有效防止泡菜過酸[11-14]。已有研究用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）共發酵白菜縮短了發酵周期，提高了食用安全性[15]，但對泡菜發酵菌劑的篩選主要還是集中在乳酸菌上，利用酵母菌或乳酸菌與酵母菌共發酵的研究仍較少。

本研究以分離自不同發酵蔬菜中的乳酸菌及酵母菌為研究對象，通過比較產酸、耐酸、耐鹽等耐受性指標及發酵特性篩選出性能較好的異型發酵乳酸菌和酵母菌組合發酵芥菜，并對發酵過程的理化指標進行檢測，得到較優的共發酵菌株組合，以期能夠應用于泡菜工業化接種強化發酵，提高產品風味及品質，為高品質泡菜的工業化生產菌劑提供更多的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

新鮮芥菜：云南昆明菜市場。本研究所用乳酸菌（L1～L6）及酵母（M1～M6）菌株均從云南不同發酵蔬菜樣品中分離純化所得，于-80 ℃保存，具體信息見表1。

表1 乳酸菌和酵母菌的來源及鑒定結果Table 1 Sources and identification results of lactic acid bacteria and yeasts

1.1.2 試劑

鹽酸、乳酸、氫氧化鈉、氯化鈉、乙酸鋅、酚酞、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、亞硝酸鈉（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

MRS培養基、孟加拉紅固體培養基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

HR/T20MM冷凍離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；CJ-2S超凈工作臺：天津市泰斯特儀器有限公司產品；WPL-125BE電熱恒溫培養箱：天津泰斯特設備有限公司；ZQZY-88AV全溫振蕩培養箱：上海知楚儀器有限公司；Multiskan GO酶標儀：美國Thermo公司；Sartorius PB-10型pH計：上海珂淮儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 耐受性分析

耐酸性測試：吸取活化后的乳酸菌和酵母菌菌液（OD600nm值=1.0）以1%（V/V）的接種量分別接種于pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和5.5的MRS液體培養基和YPD液體培養基中，乳酸菌于37 ℃靜置培養，酵母菌于30 ℃、225 r/min條件下培養24 h，測定菌液的OD600nm值。

耐鹽性測試：吸取活化后的乳酸菌和酵母菌菌液（OD600nm值=1.0）以1%（V/V）的接種量分別接種于NaCl含量為2%、4%、6%、8%、10%和12%的MRS液體培養基和YPD液體培養基中，乳酸菌于37 ℃靜置培養，酵母菌于30 ℃、225 r/min條件下培養24 h，測定菌液的OD600nm值。

1.3.2 乳酸菌產酸性能測試

吸取活化后的乳酸菌菌液（OD600nm值=1.0）以1%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養基中，于37 ℃靜置培養，每4 h取樣測定總酸含量。

1.3.3 酵母菌產氣、產璞測試

產氣：采用杜氏小管發酵法[13]。吸取酵母菌菌液（OD600nm值=1.0）以1%（V/V）的接種量接種于YPD液體培養基中，30 ℃靜置培養24 h后，觀察杜氏小管中有無氣泡產生。

產璞：吸取活化后的酵母菌菌液（OD600nm值=1.0）以1%（V/V）的接種量接種于YPD液體培養基中，30 ℃靜置培養24 h后，觀察試管中的培養基表面是否產生白膜。

1.3.4 芥菜發酵

發酵劑制備：從-80 ℃冰箱中取出菌株，乳酸菌于MRS液體培養基37 ℃靜置培養；酵母菌于YPD液體培養基30 ℃、225 r/min搖床培養，均活化2代后生長到對數生長期，備用。將活化好的菌液于6 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用無菌生理鹽水重復洗菌體3次，收集菌體。最后懸浮于同體積的無菌生理鹽水中，制成菌懸液作為母發酵劑。

芥菜發酵：將新鮮芥菜用清水洗干凈、切分后，用體積分數為75%的食品級酒精浸泡10 min，用無菌水沖洗去除酒精，按芥菜與水質量體積比2∶3（g∶L）加入泡菜水（含2%白砂糖和3%食鹽的礦泉水），接種2%的乳酸菌和2%的酵母菌，使乳酸菌終濃度＞106CFU/g泡菜，酵母菌終濃度＞105CFU/g泡菜，混合1 min后置于30 ℃恒溫發酵，以不接菌的自然發酵組（ZR）為對照，每個試驗作3個平行。

1.3.5 測定方法

pH的測定：采用pH計；總酸含量的測定：參照國標GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》第一法酸堿指示劑滴定法；亞硝酸鹽含量的測定：參照國標GB 5009.33—2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》第二法分光光度法?；罹鷶档臏y定[16]：取泡菜汁液稀釋涂布于MRS固體培養基，37 ℃恒溫培養2 d后進行乳酸菌計數；取泡菜汁液稀釋涂布于孟加拉紅固體培養基，30 ℃恒溫培養2 d后進行酵母菌計數。

感官評定：選擇12名經過專業培訓的人員，采取盲評模式分別對泡菜的色澤、質地、香氣和滋味進行評分，滿分為100分，去除最高分和最低分后，取平均分為發酵芥菜最后的得分。具體感官評分標準見表2[17]。

表2 泡菜的感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria of paocai

1.3.6 數據處理

通過Graphpad Prism8.4.3軟件繪圖；每個試驗設三個平行，使用IBM SPSS Statistics26進行顯著性檢驗，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的耐受性及產酸性能分析

2.1.1 耐酸性分析

乳酸含量對乳酸菌生長活性具有較大影響，異型發酵乳酸菌可以產生甘露醇等風味物質，增加異型發酵乳酸菌的存活時間有利于提高泡菜的感官品質[18]。6株乳酸菌的耐酸能力見圖1。

圖1 不同pH條件下乳酸菌的生長情況Fig.1 Growth of lactic acid bacteria at different pH

由圖1可知，隨著培養基pH值的降低，6株乳酸菌的生長均受到不同程度的抑制，耐酸性差異較為明顯。所有菌株在pH值為5.5時OD600nm值最大，pH≤4時幾乎沒有菌株生長。其中，菌株L2和L4在不同pH條件下的生長情況趨于一致，耐酸性均較弱；菌株L5在pH值為4.5～5.5之間的OD600nm值均高于其他菌株，說明耐酸性較好。與趙山山等[19]從貴州泡菜中分離的乳酸菌耐酸性相比，本研究所用乳酸菌均為異型發酵乳酸菌，所以整體耐酸性較差。

2.1.2 耐鹽性分析

鹽含量對泡菜發酵過程中微生物數量的影響較大[20]。6株乳酸菌的耐鹽能力見圖2。由圖2可知，隨著NaCl含量的增加，6株乳酸菌的生長不同程度地受到抑制，當NaCl含量達到10%及以上時，沒有菌株能夠生長；當NaCl含量在2%～4%之間時，菌株L2和L4的OD600nm值隨NaCl含量變化較大，抑制較為明顯；菌株L1和L5的OD600nm值隨NaCl含量變化較小，生長能力保持了比較穩定的趨勢，耐鹽性能較好。黃道梅等[21]研究也證明乳酸菌受鹽度影響較大，提高食鹽含量抑制了乳酸菌的生長。

圖2 不同NaCl含量下乳酸菌的生長情況Fig.2 Growth of lactic acid bacteria at different NaCl concentrations

2.1.3 產酸性能研究

泡菜發酵前期的乳酸菌產酸速度過快、產生的酸性物質過多會抑制乳酸菌自身及共發酵酵母菌的生長、繁殖[22]。因此，考察6株乳酸菌的產酸性能，結果見圖3。

圖3 不同乳酸菌的產酸情況Fig.3 Acid production of different lactic acid bacteria

由圖3可知，6株乳酸菌在生長代謝期間的總酸含量均處于增長趨勢，菌株L1、L2和L3的總酸含量增加較快，菌株L4、L5和L6的總酸含量增加較慢。其中，菌株L2的產酸能力最強，培養24 h時的總酸含量達到（24.58±0.08）g/L；菌株L4的產酸能力最弱，培養24 h的總酸含量僅為（7.60±0.05）g/L。

綜上，菌株L5在pH 4.5和4%NaCl含量下耐受性較好且24 h產酸量較少，所以選擇菌株L5進行后續實驗。

2.2 酵母菌的耐受性及發酵性能分析

2.2.1 耐酸性分析

真菌群落受酸度影響較大，大多數真菌的耐酸性較差[20]，為得到適合作為蔬菜發酵劑的優良酵母菌，以耐酸作為酵母菌的初步篩選指標之一。6株酵母菌株的耐酸性見圖4。由圖4可知，當pH為5.5時，所有菌株生長良好，隨著pH值降低，菌株的生長均受到抑制；當pH為4.0時，菌株M1、M2、M3和M4生長良好，菌株M5、M6受抑制較明顯；當pH為3.5時，菌株M5、M6則不能生長，菌株M1耐酸性最好。

圖4 不同pH下酵母菌的生長情況Fig.4 Growth of yeasts at different pH

2.2.2 耐鹽性分析

6株酵母菌的耐鹽性測定結果見圖5。由圖5可知，菌株M3、M5和M6在NaCl含量為6%時生長能力明顯下降，當NaCl含量增大到10%時不能生長；菌株M1、M2和M4在NaCl含量在2%～6%時生長較好，NaCl含量增大到8%時生長能力下降明顯，當NaCl含量增大到12%時不能生長。結果表明，菌株M1、M2和M4的耐鹽性相對較好。

圖5 不同NaCl含量下酵母菌的生長情況Fig.5 Growth of yeasts at different NaCl concentrations

2.2.3 發酵性能分析

一些酵母菌在發酵過程中產氣、產璞不僅會影響產品的外觀，也會破壞發酵蔬菜質地，從而影響發酵產品口感[13]。因此，對6株酵母菌的產氣、產璞情況進行測定，結果見表3。由表3可知，菌株M5產氣嚴重且少量產璞，菌株M3少量產氣不產璞，菌株M1、M2、M4和M6既不產氣也不產璞。

表3 酵母菌的產氣/產璞能力Table 3 Gas producing and film producing capacity of yeast

綜上，菌株M1、M2和M4在pH 4.0和4%NaCl含量下耐受性較好且不產氣、不產璞，所以選擇菌株M1、M2、M4分別與菌株L5進行組合發酵芥菜。

2.3 乳酸菌與酵母菌共發酵芥菜組合篩選

2.3.1 pH和總酸含量的變化

pH值和總酸含量是泡菜發酵程度的兩個重要指標，對微生物生長和代謝產物形成具有重要影響[23]。一般認為低酸發酵蔬菜總酸含量（以乳酸計）低于0.3 g/100 g，味道微酸、脆嫩、清香，且含有豐富的活性乳酸菌[7]。芥菜發酵過程中pH和總酸含量的變化見圖6。

圖6 芥菜發酵過程中pH（A）及總酸含量（B）的變化Fig.6 Changes in pH(A)and total acid(B)during mustard fermentation

由圖6可知，在發酵0～3 d，各組pH均急速下降，發酵第5天開始趨于穩定，發酵結束時沒有顯著差異（P＞0.05）。整個發酵過程中各組的總酸含量均逐漸增加，自然發酵組總酸含量最低，但一直處于上升趨勢，發酵并未完成。菌株L5和M1共發酵芥菜第4天時總酸含量最高[（1.84±0.03）g/kg]，發酵6～10 d增加較為緩慢，發酵結束時總酸含量低于其他接菌發酵組，僅為（2.30±0.03）g/kg。與李文青等[24]用腸膜明串珠菌單獨發酵的泡菜（發酵9 d總酸含量超6 g/kg）相比，本研究添加酵母菌發酵所得的泡菜總酸含量較低，均達到低酸泡菜標準[7]。

2.3.2 活菌數的變化

乳酸菌數量的增加會使pH值降低和總酸含量增加，同時乳酸菌的生長隨著產酸量的增加而受到抑制[25]。各組芥菜發酵過程中乳酸菌及酵母菌活菌數的變化見圖7。

圖7 芥菜發酵過程中乳酸菌（A）及酵母菌（B）活菌數的變化Fig.7 Changes in viable count of lactic acid bacteria(A)and yeast(B)during mustard fermentation

由圖7A可知，整個發酵過程中，乳酸菌活菌數均呈先增加后減少的趨勢，接菌發酵組均在發酵第4天時達到最高，其中菌株L5和M2共發酵組的乳酸菌活菌數最高，為（7.59±0.08）lg（CFU/mL），自然發酵組在第6天時乳酸菌活菌數最高達（7.86±0.03）lg（CFU/mL）；發酵結束時菌株L5和M1共發酵組的乳酸菌活菌數[（5.71±0.02）lg（CFU/mL）]顯著低于其他三組（P＜0.05），可能是因為酵母菌在泡菜中生長代謝與乳酸菌競爭營養成分，一定程度上抑制了乳酸菌的生長。

由圖7B可知，菌株L5和M1共發酵組的酵母菌活菌數呈先增加后減少的趨勢，發酵第2天時酵母活菌數最多，為（5.33±0.01）lg（CFU/mL），隨后開始下降，發酵結束時酵母活菌數為（2.41±0.06）lg（CFU/mL）；其他兩個接菌發酵組的酵母菌活菌數變化趨于一致，隨著發酵時間急劇下降，發酵4～10 d均未檢測到酵母活菌；自然發酵組整個發酵過程均未檢測到酵母活菌。發酵過程中微生物的多樣性、生長和存活取決于對食物生化和物理條件的耐受和反應，以及在食物微環境中適應和生存的能力[26-27]。酵母菌M2和M4在培養基中耐酸性較好，但在泡菜中耐酸性較差可能是因為泡菜水中的營養成分沒有培養基豐富，且乳酸菌生長代謝產生的物質對其也會有一定的抑制作用。

2.3.3 亞硝酸鹽含量的變化

由圖8可知，各組“亞硝峰”都出現在發酵第2天，其中自然發酵組最高為（6.30±0.04）mg/kg，菌株L5和M1共發酵組含量最低為（2.26±0.04）mg/kg，整個發酵過程的亞硝酸鹽含量均遠低于GB 2762—2017《中國食品安全國家標準食品中污染物限量》中規定的腌漬蔬菜亞硝酸鹽標準（不超過20 mg/kg）；菌株L5和M1共發酵組發酵結束時的亞硝酸鹽含量僅為（1.35±0.02）mg/kg，顯著低于自然發酵和菌株L5和M2共發酵組（P＜0.05），但與菌株L5和M4共發酵組無顯著差異（P＞0.05），安全性較高。本研究發酵過程中亞硝酸鹽含量均很低，可能是因為對芥菜進行了減菌處理，且乳酸菌發酵快速酸化，抑制了有害菌的生長代謝和亞硝酸鹽的產生[28-29]。

圖8 芥菜發酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.8 Changes in nitrite content during mustard fermentation

2.3.4 感官評分的變化

酵母菌發酵蔬菜可以產生有機酸、醇類、酯類、氨基酸類等物質，而且生成的醇類還可以與有機酸形成酯類，共同增加泡菜的風味[30]。泡菜發酵10 d后進行感官評定，結果見表4。由表4可知，自然發酵組芥菜未發酵成熟，色澤偏綠，無泡菜香味且有生澀味，總體評分較低，感官評分為（61.17±2.34）分；菌株L5和M1共發酵芥菜的顏色透亮、有光澤，有獨特的壇香味，香氣濃郁且純正，脆度高，品質均一；色澤（22.08±0.86）分、質地（21.75±0.83）分、香味（20.08±0.76）分、滋味評分（21.08±1.11）分和總評分（85.00±2.12）分均顯著高于其他3組（P＜0.05），可能是因為菌株M1在泡菜水中存活的時間較長，所以產生的風味物質更多。

表4 自然發酵及不同菌株組合發酵芥菜的感官評分Table 4 Sensory scores of natural fermentation and different strains combination fermentation of mustard

3 結論

本研究運用不同泡菜來源的6株異型發酵乳酸菌（L1～L6）和6株酵母菌（M1～M6），通過耐鹽、耐酸、產酸等性能篩選出在pH 4.5和4%鹽濃度耐受性較好且24 h產酸量較少[（10.44±0.01）g/L]的腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）L5；以及在pH 4.0和4%鹽濃度耐受性較好且不產氣、不產璞的少孢哈薩克斯坦酵母（Kazachstania exigua）M1、庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）M2和二孢接合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）M4。將菌株L5與M1共發酵芥菜的總酸[（2.30±0.03）g/kg]和亞硝酸鹽含量[（1.35±0.02）mg/kg]更低，乳酸菌活菌數[（5.71±0.02）lg（CFU/mL）]更少，也存在一定的酵母活菌；感官評分[（85.00±2.12）分]最高。本研究初步證明了不同酵母菌菌株對發酵過程產生影響，提示選用適合的乳酸菌和酵母菌組合對生產低酸泡菜具有重要意義，為人工接種發酵低鹽低酸泡菜菌劑的選擇提供了參考依據。