基于生物信息學分析動脈粥樣硬化的關鍵基因及潛在中藥*

段凱旋,曹珊,祁祥,聶興源

河南中醫藥大學,河南 鄭州 450046

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種由脂質和纖維物質過度積聚,導致動脈變得狹窄和硬化的慢性炎癥性疾病,是許多致命性心血管疾病的病理基礎[1-2]。據世界衛生組織(WHO)公布,全球每年約1 700萬人死于心血管疾病,其中AS是最主要的致死原因[3]。隨著藥物、手術和介入等療法的不斷發展,AS的病死率呈下降趨勢。盡管他汀類藥物在AS的治療方面取得了一些進展,但單一化學成分藥物對多基因、多因素相關的AS疾病的療效并不理想[4]。AS的病因非常復雜,涉及家族性高膽固醇血癥(familial hypercholesterolemia,FH)、高脂血癥、高血壓、吸煙、糖尿病、肥胖、免疫損傷和遺傳因素等[5]。由于AS病因復雜,并發癥多,確定與AS相關生物標志物,不僅可以改善患者的治療,降低發病風險,還可以指導新療法的設計。

微陣列常用于進行大規模生物信息學研究,闡明多個不同基因與特定疾病之間的關系[6]。自21世紀以來,生物信息學技術越來越多地用于挖掘疾病的潛在遺傳靶點,助力研究人員鑒定與AS發生和發展相關的差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)及其潛在通路[7-8]。研究發現,微陣列已被廣泛用于預測AS的潛在靶點[9]。例如,最近的一項綜合生物信息學分析強調了腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號通路在AS發展中的作用[10]。故本研究通過獲取GSE13985和GSE6088數據集,進行樣本的GEO2R分析,得出DEGs分為上調基因和下調基因。進一步利用生物信息學方法分析相關生物學過程,以期為中醫藥治療AS探索新的靶點。

1 材料與方法

1.1 數據集的獲取以“Atherosclerosis”為關鍵詞,在美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)創建并維護的GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)[11]檢索篩選與AS研究相關的數據集GSE13985(平臺GPL570)和GSE6088(平臺GPL570)。

1.2 DEG的數據處理使用GEO2R工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)識別AS樣本中DEGs,設置篩選標準|log2FC|>1且P<0.05,利用R(3.6.3版本)的“pheatmap”包和“ggplot2”包將表達數據以熱圖和火山圖呈現,同時篩選出兩個數據集中共同表達的上調、下調DEGs以韋恩圖呈現。

1.3 DEGs的富集分析將“1.2”項獲取的共同DEGs導入DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery;https://david.ncifcrf.gov/)數據庫[12],利用R的“ggplot2”包進行基因本體(Gene Ontology,GO)功能富集分析、京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析(P<0.05)。根據P值選取最佳結果進行可視化分析。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡和Hubba插件分析為了探究DEGs之間的相互作用,將上調、下調的DEGs導入到STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes;https://string-db.org/)數據庫中構建PPI網絡,最高置信度大于0.900[12]。保存結果并下載TSV文件導入Cytoscape 3.9.1,基于cyto-Hubba插件根據度值進行基因排名,獲取前10個最高程度值Hub基因及前4個關鍵基因。

1.5 核心基因中藥及成分預測將排名靠前的核心基因作為預測靶標,以P<0.05為標準將其導入醫學本體信息檢索數據庫(Coremine Medical)中,以藥物被《中華人民共和國藥典》收錄為條件,進一步篩選對各預測靶標具有生物學效應的前10位中藥并統計頻數[13]。

2 結果

2.1 DEGs分析使用PCA來驗證數據集GSE13985和GSE6088的可重復性。根據PCA,數據集GSE13985和GSE6088的組內可重復性是可靠的(圖1)。GSE13985包含5例FH組,5例對照健康組;GSE6088包含3例純合FH組,7例雜合FH組,13例健康組。在GSE13985數據集中總共鑒定出 2 135 個DEGs(744個上調,1 391個下調)(圖2),在GSE6088數據集中鑒定出1 725個DEGs(773個上調,952個下調)(圖3)。其中,兩個數據集共有186個上調的DEGs和220個下調的DEGs(圖4)。

圖1 GSE13985和GSE6088的PCA驗證

注:A:GSE13985數據集中前40個DEGs的表達熱圖;B:GSE6088數據集中前40個DEGs的表達熱圖。

注:A:GSE13985數據集對應的火山圖;B:GSE6088數據集對應的火山圖。

注:A:GSE13985和GSE6088數據集中的上調DEGs;B:GSE13985和GSE6088數據集中的下調DEGs。

2.2 GO功能、KEGG通路富集分析GO功能富集分析顯示406個DEGs主要通過對核糖體RNA代謝過程、β-連環蛋白TCF復合物組裝、RNA剪接、RNA轉錄、RNA轉錄后加工、脂質磷酸化、肽基賴氨酸修飾、酯交換反應、組蛋白修飾等生物過程影響AS;其影響的分子功能主要定位在賴氨酸乙?；M蛋白結合、乙?；蕾囆缘鞍捉Y合、鈣黏蛋白結合、細胞黏附分子結合、甲狀腺激素受體結合、轉錄輔壓子活性、轉錄輔激活因子活性、核激素受體結合、組蛋白甲基轉移酶活性、激素受體結合、細胞-基質-黏附物結、細胞皮層、剪接體復合體、黑素小體、色素顆粒等;細胞組分參與U2型催化前剪接體、U12型剪接體復合體、催化前剪接體、黏著斑、組蛋白甲基轉移酶復合物、甲基轉移酶復合物、液泡膜、溶酶體膜等(圖5)。

注:A:DEGs和前15個GO功能的富集結果,紅色表示上調基因,藍色表示下調基因;B:前12個GO功能富集的Z-score結果。

KEGG通路主要包括代謝途徑、缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)信號通路、沙門菌感染、剪接體、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、甲狀腺激素信號通路、RNA降解、腎細胞癌、前列腺癌、磷脂酰肌醇信號系統、癌癥中的膽堿代謝、急性髓系白血病、賴氨酸降解、粘合連接、乙型糖尿病等(圖6)。

注:A:DEGs與前10條KEGG通路之間的關系;B:對應DEGs和前10條富含KEGG二級通路的關系。

2.3 PPI網絡構建和Hub基因確定采用STRING數據庫構建DEGs的PPI網絡,確定DEGs相互之間作用關系,其中,主要涉及313個節點,982條邊(圖7),將DEGs信息導入Cytoscape3.9.1,利用cyto-Hubba插件,構建DEGs上調、下調基因PPI(圖8)。根據度值確定前10個Hub基因,分別為CTNNB1、POLR2A、CREBBP、BPTF、SMARCA4、KMT2D、KMT2A、POLR2F、SETD1A和HSPA5。其中,前4個關鍵基因為CTNNB1、POLR2A、CREBBP和BPTF(圖9和表1)。

表1 Top模塊中前10個基因的程度

圖7 基于STRING數據庫構建DEGs的PPI網絡圖

注:紅色為上調基因;藍色為下調基因。

圖9 使用cyto-Hubba根據度值確定前10個Hub基因及前4個關鍵基因(基因按照顏色從深到淺的程度降序排列)

2.4 抑制AS的中藥篩選最終得到與關鍵基因相關的中藥共122種,根據頻數統計,黃芩、人參、三七、桑葉、藏紅花、冬蟲夏草、雷公藤可同時作用于3個靶基因,結果提示上述中藥具有多靶點多機制發揮治療AS的潛力,頻數統計結果見表2。

表2 抑制AS的中藥預測

3 討論

AS作為一種慢性炎癥性疾病,其主要特征是膽固醇升高、血管壁增生、脂質堆積等[14-15]。膽固醇是類固醇激素的前體,也是細胞膜的重要組成部分。膽固醇的合成、吸收及排泄改變的人群易患AS起源的心血管疾病[16]。過量的膽固醇可以加重AS,引起動脈管壁狹窄,并在動脈內膜形成斑塊[17]。FH是常見的遺傳性代謝疾病之一,血液中異常高水平的低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)會導致AS過早發作。

本研究通過獲取GSE13985和GSE6088數據集,進行樣本的GEO2R分析,得出DEGs分為上調基因和下調基因。其中分析GSE13985數據集,確定了744個上調和1 391個下調與AS相關的DEGs;分析GSE6088數據集,確定了773個上調和952個下調與AS相關的DEGs。GO功能和KEGG通路富集分析表明,AS中的DEGs主要參與核糖體RNA代謝過程、RNA剪接、酯交換反應、組蛋白修飾、黏著斑、細胞-基底黏附結和代謝途徑,涉及HIF-1信號通路、甲狀腺激素信號通路等。抑制AS的中藥篩選結果表明,黃芩、藏紅花、冬蟲夏草等可以通過關鍵靶基因CTNNB1、POLR2A、CREBBP富集在代謝途徑和HIF-1信號通路發揮抗AS作用。

AS的早期階段,高膽固醇血癥會增加LDL的浸潤和滯留,釋放炎癥因子,激活炎癥細胞[18]。LDL與其受體(LDLR)的結合促進其吸收和釋放游離膽固醇,LDL與肝臟分泌的游離失脂蛋白結合形成脂蛋白a,并與細胞外基質結合沉積在血管中,在LDL過量的情況下導致AS發生[19]。HIF-1α主要通過轉錄激活、調節內皮細胞、巨噬細胞和平滑肌細胞的反應,從而促進AS的發展[20]。血管內皮細胞的缺氧是加速AS過程的另一個重要因素,它會導致血管內皮細胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)增加,加劇脂質氧化,并在缺氧條件下引起蛋白質和核酸變性[21]。HIF-1α可以促進血管生成、AS斑塊中的炎癥細胞浸潤、平滑肌細胞的增殖和遷移以及促進巨噬細胞泡沫化[22]。斑塊內缺氧和血紅蛋白:結合珠蛋白復合物激活巨噬細胞中HIF-1α依賴性信號,導致血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)分泌增強,進而增加斑塊內血管生成、血管通透性和白細胞募集[23]。

通過Cytoscape軟件插件分析,與AS相關的hub基因主要是CTNNB1、POLR2A和CREBBP。故CTNNB1、POLR2A和CREBBP有望成為新型治療AS藥物開發的生物標志物。由于AS的發病機制與多基因遺傳相關,表觀遺傳修飾對心血管疾病發病和防治起著重要作用[24]。表觀遺傳學是不斷發展的生物醫學研究領域。在AS中,多種血管細胞(主要包括內皮細胞、血管平滑肌細胞和單核細胞/巨噬細胞)存在整體表觀遺傳改變,從而補充遺傳異常[25]。CTNNB1基因編碼的蛋白β-catenin是一種黏著連接蛋白,與鈣黏蛋白、α-catenin共同組成黏附連接復合體,調控細胞生長以及細胞間的黏附,對上皮細胞層的構建與維持起著重要作用[26]。CTNNB1即WNT/β-catenin信號通路,經典的WNT/β-catenin通路在心血管疾病的幾種病理生理機制中起著關鍵作用,例如炎癥、鈣化、纖維化和脂質浸潤等[27]。WNT/β-catenin通路的激活增強了與炎癥、內皮功能障礙、血管平滑肌細胞增殖和血管鈣化有關靶標的轉錄[28]。POLR2A是細胞存活的必需基因,參與催化活性和轉移酶活性,對大多數蛋白質編碼基因的轉錄至關重要,包括細胞增殖、遷移等[29]。POLR2A的丟失會觸發整體基因表達的失調并促進衰老表型,最終造成細胞異常死亡[30]。CREBBP是一種多功能轉錄共激活因子,可與多種轉錄因子相互作用并充當組蛋白乙酰轉移酶,同時也參與細胞轉錄、血管重塑、內膜增生、細胞凋亡和信號傳導等生物學功能[31-32]。由于CREBBP受多種途徑調控,CREBBP缺陷型平滑肌細胞在體外表現出血清非依賴性增殖和肥大,并分泌可刺激外膜成纖維細胞增殖和表達細胞外基質蛋白的可溶性因子促進AS發生[33]。CREB蛋白不僅可以維持肝臟脂質代謝,而且在脂質合成、脂肪酸氧化和脂蛋白代謝的調節中,可以通過刺激Bnip3誘導的線粒體自噬來改善肝臟脂質代謝和肝功能,從而減少線粒體依賴性細胞死亡并防止肝脂肪變性、纖維化[34]。隨著對表觀遺傳學的深入研究,染色質調控因子在心肌缺血再灌注損傷、高血壓、AS等心血管疾病中發揮重要作用[35]。通過關鍵基因CTNNB1、POLR2A和CREBBP反向預測相關的中藥,獲得了黃芩等7種中藥。從中提煉出AS主要以活血化瘀、益氣滋陰為基本治法,為臨床運用中醫藥治療AS提供有益參考。

4 結語

FH對于AS的形成至關重要,遺傳變異可以調節LDL-C的水平促進AS發展。借助生物信息學分析,發現中藥黃芩、人參、三七等7種中藥通過關鍵基因CTNNB1、POLR2A和CREBBP富集在代謝途徑和HIF-1信號通路上發揮抗AS作用。CTNNB1、POLR2A和CREBBP這3個基因有望成為診斷AS生物標志物的關鍵Hub基因,為進一步深入探索診斷AS提供靶點,也為中醫藥治療AS的研究提供新的理論依據。