葛根素對妊娠期糖尿病大鼠母體和胎兒的影響

錢 坤,宋祎一,曹 莉

[1. 蘇州大學醫學院,江蘇 蘇州 215123;2. 天大藥業(珠海)有限公司,廣東 珠海 519070]

妊娠糖尿病(gestational diabetic mellitus,GDM)是指在懷孕期間首次發病或首次被發現的碳水化合物不耐受導致的高血糖,是目前妊娠期最常見的并發癥之一。隨著人們飲食生活習慣的改變及婚育年齡的推遲,我國GDM的發病率明顯上升。一份2019年發表的文獻報告利用Mate分析對2013-2017年報道我國GDM發生率的25 篇論文進行了進一步匯總分析,統計受試者79 064 名,結果顯示GDM在中國的發病率高達12.8%～16.7%[1]。2022年一份對我國41 067 名妊娠婦女的臨床研究報道GDM發病率為16.3%[2]。GDM不僅可引發糖尿病并發癥、妊娠高血壓、羊水過多、胎膜早破、感染、早產、難產等,對母親健康造成嚴重威脅;還易引發胎兒畸形、缺氧、巨大兒及新生兒呼吸窘迫綜合征、低血糖和其他并發癥,增加胎兒和新生兒的死亡率[3-4]。因此,GDM的治療及相關不良妊娠的控制受到廣泛重視。

許多中藥都有調控血糖的藥效,特別是藥食兩用的葛根廣受關注。葛根的傳統功效為解肌退熱、生津止渴、升陽止瀉、透發疹斑等。葛根素(puerarin, Pue )是葛根中提取的一種異黃酮類成分,化學名為4,7-二羥基-8-β-D-吡喃葡萄糖醛基異黃酮,現代藥理學研究表明其具有改善微循環、抑制醛糖還原酶活性、改善胰島素抵抗和降血糖等作用,在臨床上Pue不僅用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞,其應用于糖尿病及并發癥的輔助治療也已有30余年的歷史[5-6]。諸多研究者對Pue與其他藥物聯合應用治療GDM進行了臨床和實驗探索[7]。然而目前單獨評價Pue,特別是口服Pue可否有效控制GDM母體血糖水平,改善妊娠結局,尚罕見報道。本文建立GDM大鼠模型,觀察口服Pue對GDM母體的療效及對胎兒生長發育的影響,為臨床用藥提供客觀的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級SD大鼠,雌性70 只,雄性20 只,體質量(250±20) g;由蘇州大學實驗動物中心提供,生產許可證號：SCXK(蘇)2007-2008,使用許可證號：SYXK(蘇)2007-0037。SPF動物房環境溫度(22±2) ℃,相對濕度40%～70%,晝夜交替12 h。

1.2 試劑鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),BioFroxx 公司(批號：EZ2921B400);Pue,西安艾沃生物科技有限公司(純度：80%,批號：AW-110821);鹽酸二甲雙胍片(metformin, Met)昆山培力藥品有限公司(批號：1112136);50%葡萄糖注射液,中國大冢制藥有限公司(批號：1H89H20);檸檬酸,南京新百藥業有限公司(批號：0806117);檸檬酸鈉,中諾藥業有限公司(批號：08089416);戊巴比妥鈉,Sigma 公司(批號：P3761);生理鹽水,山禾齊都藥業有限公司(批號：15B21121003);4%多聚甲醛通用型組織固定液,蘭杰柯科技有限公司(批號：22343640)、血糖試紙,三諾生物傳感股份有限公司(批號：3824NE)。

1.3 儀器電子天平(上海精天電子儀器有限公司;FA604A)、電子分析天平(Mettler Toledo;ME104)、pH計(Mettler Toledo;Five Easy Plus)、血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司,GA-3)。

1.4 方法

1.4.1GDM大鼠模型建立及給藥方案[8]將大鼠按雄雌比例2 ∶1合籠,次晨檢查雌鼠陰道口及籠具底盤,發現有陰栓者定為妊娠第1天,標記孕鼠,記錄孕期,并將雌、雄鼠分開。除正常對照組外,其余孕鼠用于制備GDM模型：孕鼠妊娠第5晚禁食12 h后,按30 mg·kg-1劑量尾靜脈注射2%的STZ溶液(需用檸檬酸緩沖液新鮮配制：檸檬酸2.1 g加入雙蒸水100 mL中配成A液,檸檬酸鈉2.94 g加入雙蒸水100 mL中配成B液。STZ藥液配制：將A、B液按1 ∶1混合后,調整pH至4.4,加入STZ配置成2%的STZ溶液)。注射后立即給予大鼠正常供食供水。注射72 h后,用血糖儀檢測孕鼠空腹血糖(提前禁食8 h)?？崭寡?1.3 mmol·L-1以上,且尚未流產者為造模成功。

將造模成功的孕鼠,根據其空腹血糖,均勻分為模型對照組(Model組)、陽性對照二甲雙胍組(Met組)、葛根素組(Pue組),每組20只。將未造模的10只孕鼠設為正常對照組(Control組)。各組均按5 ml·kg-1體質量連續灌胃給藥12 d,Met給藥劑量為160 mg·kg-1,Pue給藥劑量為250 mg·kg-1,Model組及Control組均給予等體積蒸餾水。

1.4.2孕鼠空腹血糖監測及糖耐量實驗 分別于給藥第5天、第10天檢測尚未流產的孕鼠糖耐量。孕鼠禁食8 h后,按2 g·kg-1的劑量灌胃給予50%葡萄糖溶液,分別于0 min、30 min、60 min、120 min尾靜脈取血,用血糖儀即時檢測各時間點的血糖值(BG),并計算血糖曲線下面積(AUC=(BG 0+BG 30)×0.5/2+(BG 30+BG 60)×0.5/2+(BG 60+BG 120)×0.5/2)。另外,分別于首次給藥前,以及末次給藥1 h后,以同樣方法檢測孕鼠空腹血糖值(見 Fig 1)。

Fig 1 The schematic experimental schedule

1.4.3監測孕鼠常規狀態 每日記錄孕鼠體質量,觀察基本體征,記錄流產情況,計算各組流產率=流產孕鼠只數/孕鼠總只數×100%。

1.4.4胎鼠血糖及生長情況檢查 孕鼠妊娠第19晚禁食10 h,次日末次給藥1 h后,麻醉行剖腹產,依次剪開孕鼠腹部皮膚、肌肉層、子宮壁、羊膜囊,剝離胎盤,取出胎鼠,觀察畸形情況并計算各組胎鼠宮內生長受限發生率=孕育宮內生長受限胎鼠的孕鼠只數/未流產的孕鼠只數×100%。稱量胎盤重量、胎鼠的身長(頭頂至尾尖)、尾長(尾根至尾尖)、體質量;分離胎鼠心臟、肝臟、腎臟及腦組織。摘取胎心時,將滴出的血液滴入血糖試紙,用血糖儀檢測胎鼠血糖。各臟器用濾紙吸取血液后,稱量重量,并計算臟器指數=臟器重/體質量×100%。

2 結果

2.1 Pue對GDM孕鼠空腹血糖及糖耐量的影響

結果僅統計未流產的孕鼠數據(Control 組10只, Model組8只,Met組13只,Pue組16只)。給藥治療前,GDM孕鼠空腹血糖明顯高于Control組,有顯著性差異(P<0.01),Model組、Met組、Pue組GDM孕鼠空腹血糖水平相當。給藥后,Met組孕鼠空腹血糖逐漸降低,末次給藥后空腹血糖低于給藥前,有顯著性差異(P<0.01),但仍未降到正常水平;Met組孕鼠末次給藥后空腹血糖與Control組相比有顯著性差異(P<0.01);Pue組孕鼠空腹血糖高的狀況與其給藥前比較,未見明顯改善(P>0.05),但與Model組孕鼠持續升高的空腹血糖相比,已得到明顯控制,兩組間比較有顯著性差異(P<0.01)(見Fig 2A)。給藥第5天,兩個給藥組孕鼠糖耐量均得到一定程度的改善,AUC均明顯低于Model組,有顯著性差異(P<0.01)(見Fig 2B、2C);給藥第10天,Met組孕鼠糖耐量進一步改善,Pue組則與其第5天相比變化不大(見Fig 2D、2E)。

Fig 2 Effect of oral Pue on fasting blood glucose and glucose tolerance in pregnant rats

2.2 Pue對GDM孕鼠基本體征的影響孕鼠靜脈注射STZ后,體質量下降,由于尿量增多,墊料易潮濕并有爛蘋果氣味,毛色失去光澤。隨著孕期延長,各組孕鼠的平均體質量均有所增加。但在妊娠末期(妊娠第19天),GDM各組孕鼠體質量均明顯低于Control組,具有顯著性差異(P<0.01),且體質量個體差異大,其主要原因是GDM引起的流產導致孕鼠體質量突然下降,這種情況在Model組尤為明顯(見Fig 3A)。將各組未流產的孕鼠和中途流產的孕鼠體質量分開統計,則Model組未流產孕鼠體質量較Control組略有增高,而流產鼠體質量則低于其自身孕初期體質量;兩個給藥治療組未流產孕鼠體質量明顯小于Control組和Model組,差異均具有統計學意義(P<0.05,P<0.01),而這兩個給藥組流產鼠的體質量則較Model組流產孕鼠明顯增加,且均有顯著性差異(P<0.05,P<0.01),兩組之間差異無統計學意義(P>0.05)(見Fig 3B)。

Fig 3 Effect of oral Pue on body weight of pregnant rats

2.3 Pue對GDM孕鼠流產率的影響各組GDM孕鼠均有流產現象,流產后有的尚可見子宮內留存有胎盤,有的子宮內已無殘留,僅見子宮供血血管依舊擴張充盈(見Fig 4A、4B)。Control組無孕鼠流產;Pue組孕鼠流產率為20%,僅為Model組孕鼠流產率(達60%)的1/3,比Met組(孕鼠流產率為35%)降低了15%(見Fig 4C)。

Fig 4 Effect of oral Pue on rate of abortion in pregnant rats

2.4 Pue對GDM胎鼠血糖及宮內生長受限的影響在妊娠第20天,對孕鼠行剖腹產。在部分孕鼠子宮內發現有宮內生長受限胎鼠(體質量<1 g,且身體顏色明顯偏黃),Model組宮內生長受限發生率達62.5%,Pue組為56.3%,Met組為30.8%(見Fig 5A、5B),Control組未見宮內生長受限胎鼠。胎鼠血糖僅統計無生長受限的胎鼠。Model組胎鼠血糖明顯高于Control組,有顯著性差異(P<0.01);Pue組胎鼠血糖值較Model組降低明顯,有顯著性差異(P<0.01),但仍明顯高于Control組,差異也具有統計學意義(P<0.05);而Met組胎鼠血糖不僅明顯低于Model組,甚至低于Control組,且均有顯著性差異(P<0.01),見Fig 5C。

Fig 5 Effect of oral Pue on blood glucose and growth restriction in fetal rats

2.5 Pue對GDM胎鼠生長發育的影響胎鼠數據僅統計無生長受限的胎鼠。GDM各組胎盤重量較Control組明顯增加,具有顯著性差異(P<0.05),各給藥組與Model組比較,差異無統計學意義(P>0.05)(見Fig 6A);Model組胎鼠體質量、身長都大于Control組,差異具有統計學意義(P<0.01),Met組和Pue組胎鼠體質量和身長均接近Control組,明顯低于Model組,有顯著性差異(P<0.01);Pue組胎鼠體質量偏輕,身長較短,但與Control組和Met組比較,差異均無統計學意義(P>0.05)(見Fig 6A、6B)。

Fig 6 Effect of oral Pue on body weight, placenta weight, body length and tail length in fetal rats

與Control組胎鼠相比,Model組胎鼠的腦重指數明顯降低,組間比較差異顯著(P<0.01);心重指數和肝重指數也呈現一定的降低趨勢,腎重指數則表現出一定升高,但都與Control組相比,差異無統計學意義(P>0.05)。與Model組胎鼠相比,Met組和Pue組胎鼠腦重指數均明顯增加,具有統計學差異(P<0.05,P<0.01),其中Pue組更接近Control組水平。Pue組胎鼠心重指數和肝重指數較Model組增高明顯,具有顯著性差異(P<0.05,P<0.01)(見 Tab 1)。

Tab 1 Effect of oral Pue on organ indices of heart, liver, kidney and brain in fetal

3 討論

妊娠期母體在多種激素的相互作用和能量代謝明顯改變的狀況下,更容易發生胰島素抵抗和糖代謝異常,進而引發糖尿病,約50%的GDM孕婦會成為終身糖尿病患者[9]。此外,GDM孕婦感染、妊高征、酮癥酸中毒的患病率明顯高于正常孕婦,同時羊水量異常、胎盤早剝、流產、早產;胎兒畸形、宮內發育遲緩、巨大兒,以及新生兒死亡等不良妊娠結局的發生率均明顯增加[10-11]。有些嬰兒即使在出生時未表現出明顯異常,然而其一些重要臟器的功能卻潛在諸多患病風險[12]。因此,對GDM的治療不僅要控制孕婦的血糖水平,改善其胰島素敏感性;更應降低孕婦及胎兒GDM相關并發癥的發生。我國2022版《妊娠期高血糖診治指南》[13]和美國2023版指南(《糖尿病分類與診斷》《妊娠期糖尿病管理》)在GDM藥物治療上均建議把胰島素作為治療GDM的首選藥物[14-15]。然而,GDM患者對注射的給藥方式接受度不高,而口服用藥則具有更高的依從性。

有臨床研究者利用Mate分析比較三種降糖藥(胰島素、甘布瑞德和Met)用于GDM的有效性和安全性,結果顯示：與甘布瑞德和胰島素相比,Met不僅能顯著降低母親餐后血糖水平及新生兒進入新生兒重癥監護室的比例,而且新生兒體質量明顯下降[16]。但本實驗結果顯示：雖然Met確實可以降低GDM流產率和胎兒宮內生長受限發生率,但卻可引起胎鼠血糖顯著低于正常胎鼠。葡萄糖是妊娠期胎兒能量的主要來源,因此這一點不該被忽視。這與中美指南中指出的Met和格列本脲都可通過胎盤屏障影響胎兒,存在潛在的風險是一致的[13-15]。同樣其他口服化學降糖藥物也都缺乏長期安全性數據。因此,很多研究者和臨床醫生期望在中藥中尋找治療GDM安全有效的口服藥物。

Pue就是目標之一[17],然而Pue用于治療GDM的療效和安全性同樣有待深入研究。本文通過尾靜脈注射STZ的方法建立GDM大鼠模型,從孕鼠和胎鼠兩個角度,比較全面地評估了口服Pue治療GDM及干預其妊娠結局的作用。實驗結果顯示：口服Pue確實可以顯著緩解GDM持續升高的空腹血糖,改善其糖耐量,雖然在降低孕鼠和胎鼠血糖方面效果不如Met;但在降低流產率和緩解GDM導致的母體體質量過度增加方面則優于Met。這提示Pue降低GDM流產率和控制母體體質量方面的作用機制不僅僅是控制血糖和改善糖代謝,很可能與其改善微循環和抑制炎癥應激等機制有關[17-18]。Pue組胎鼠的血糖顯著低于Model組,但仍高于正常胎鼠。該結果提示：由于Pue干預母體血糖效果并不算理想,以及其在改善子宮內膜微循環方面的潛在機制,使胎鼠血糖未得到很好的控制。另外,Pue組孕鼠的流產率雖然最低,但胎兒宮內生長受限發生率卻接近Model組,這說明Pue在改善胎盤功能方面療效也算不理想。但在無生長受限的胎鼠生長發育的相關指標上,口服Pue卻表現出減少巨大兒的發生,促進胎兒重要臟器的發育的作用。Model組胎鼠,體質量和身長均顯著高于Control組,這與臨床上GDM巨大兒發生率高是一致的;Met組和Pue組胎鼠體質量和身長均接近Control組;GDM各組胎盤重量都顯著高于Control組,但Pue組最接近于Control組。進一步稱取胎鼠的心、肝、腎、腦等重要臟器,計算并比較臟器指數可初步判斷這些器官的發育情況。Model組胎鼠腦的臟器指數顯著低于Control組,摘取臟器時,也明顯發覺Model組胎鼠較其他組胎鼠的腦組織更軟嫩易碎;而Met組和Pue組胎腦的臟器指數均顯著高于Model組,且Pue組胎腦無論是臟器指數還是質地都更接近于正常胎鼠。Model組胎鼠心、肝、腎的臟器指數與Control組比較雖無統計學意義,但也表現出一定的變化趨勢,即：心、肝的臟器指數降低,而腎的臟器指數升高;這些趨勢在Met組和Pue組均得到了明顯的緩解。對胎鼠腦、心、肝、腎進行石蠟切片和HE染色,未能發現組織形態學上明顯的差異,這可能與石蠟切片制備過程中多次脫水有關。這些結果提示：Pue可明顯改善GDM引起的胎兒重要臟器發育異常,降低其日后潛在患病風險。

綜上所述,單獨口服降糖藥用于治療GDM,無論是西藥的Met還是中藥中提取的Pue,均未能達到十分令人滿意的療效,盡管其中的機制尚不清楚,且大鼠與人之間存在種屬差異,但本實驗結果仍可給臨床用藥提供一定的有價值的參考。中美兩國指南中均指出70%～85%的GDM患者可以僅通過改變生活方式控制血糖水平,對GDM孕婦進行健康管理可改善妊娠結局(證據等級A級)[13-15]。近一步結合本文實驗結果,提示：根據GDM患者病情和胎兒發育情況,確定不同方案的綜合療法更為可行。