基于TGF-β1/Smads信號通路探討2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-環己二酮抗肝纖維化的作用機制

黃 湘,方坤鳳,范氏泰和,梁杏梅,黃仁彬,李學政

(1.廣西衛生職業技術學院,廣西 南寧 530023;2.廣西平南縣婦幼保健院,廣西 平南 537300;3.廣西中醫藥大學附屬國際壯醫醫院,廣西 南寧 530001;4.廣西醫科大學藥學院,廣西 南寧 530021)

肝纖維化是肝臟受到多種因素慢性刺激后發生的一種保護性修復反應,是肝炎進一步發展的必經之路,同時其進一步發展可演變為肝硬化,甚至肝癌[1-2]。導致肝臟損傷的因素有病毒、酒精、化學物質、寄生蟲等。肝臟損傷如得到及時終止,肝臟可恢復正?；蛐纬傻母卫w維化可逆轉,但是如果持續刺激,肝纖維化難以逆轉并進一步發展為肝硬化或肝癌[3-4]。因此肝纖維化是肝臟損傷修復失衡的結果,減輕或逆轉肝纖維化過程可以有效預防肝硬化和肝癌的發生。

楊桃根(AverrhoacarambolaL.)為醡漿草科多年生植物,根可入藥。前期本課題組研究發現,楊桃根提取物對四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)誘導小鼠急性肝損傷及大鼠肝纖維化具有保護作用[5-6]。然而其中有效作用成分未知,為進一步探究楊桃根提取物中有效抗肝纖維化作用的成分,本研究擬對楊桃根醇提取物中單體化合物2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-環己二酮(2-dodecyl-6-methoxycyclohexa-2,5-diene-1,4-dione, DMDD)進行驗證,探討其對肝纖維化的影響及潛在作用機制[7]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑SD大鼠,SPF級,雄性,體質量(180±20)g。購買于具備合格實驗動物生產許可證和使用許可證的廣西醫科大學實驗動物中心,并飼養于標準實驗室中。實驗動物生產許可證：SCXK桂2014-0002,實驗動物使用許可證：SYXK桂2014-0003。DMDD自行提取,純度為96.7%。秋水仙堿(廣東彼迪藥業有限公司)、CCl4(分析純AR,阿拉丁公司)、通用SP試劑盒(小鼠/兔鏈霉卵白素-生物素法檢測系統,北京中杉金橋生物技術有限公司)、免疫組化抗原修復緩沖液(粉劑型檸檬酸法)(邁新試劑生物試劑有限公司)、門冬氨酸轉移酶(aspartate transferase,AST)、丙氨酸轉移酶(alanine transferase,ALT)、白蛋白/球蛋白(albumin/globulin, A/G)、總蛋白(total protein,TP)、總膽紅素(total bilirubin,T-BIL)、總蛋白定量測定試劑盒(BCA法)試劑盒(南京建成生物工程研究所),大鼠透明質酸(hyaluronic acid,HA)、層粘連蛋白(laminin,LN)、Ⅲ型膠原(collagen type Ⅲ,ColⅢ)和Ⅳ型膠原(collagen type Ⅳ,ColⅣ)試劑盒(上海源葉生物科技有限公司),鼠抗Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ,ColⅠ)抗體(Abcam公司),鼠抗轉化生長因子β1(transformed growth factor β1,TGF-β1)、兔抗Smad 2、兔抗Smad 4抗體(Cell Signaling Technology公司),鼠抗α平滑肌肌動蛋白(α smooth muscle actin,α-SMA)抗體(Merck millipore公司),鼠抗Smad 7抗體(Santa Cruz Biotechnology公司),RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒[TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司]。

1.2 儀器PCR儀、實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystem 公司),顯微鏡(OLYMPUS,BX53),病理組織包埋機(上海萊卡儀器有限公司),酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司),高速低溫離心機(Eppendorf, 5810R),勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司),電熱垂直電泳儀、轉膜儀(Bio-RAD公司),化學發光成像系統(北京賽智創業科技有限公司)。

1.3 動物分組、給藥方法及模型建立取70只大鼠,雄性,SPF級,體質量(180±20)g,適應性喂養1周后,隨機平均將大鼠分為I-V組。其中第I組給予橄欖油,其他組給予50% CCl4造模,劑量均為1 mL·kg-1,每周2次。期間在第6～8周分別隨機各取1只大鼠做肝纖維化檢測。第9周開始給予藥物干預,陽性對照組給予秋水仙堿(0.2 g·kg-1),DMDD分為高劑量組(25 mg·kg-1),低劑量組(6.25 mg·kg-1),各組給藥容積均為10 mL·kg-1,每天灌胃給藥1次,共4周[8]。正常對照組按等體積給予生理鹽水作為對照。給藥期間同法造模。

1.4 標本采集采用水合氯醛麻醉后,經腹主動脈采集大鼠血液。頸椎脫臼處死后采集肝臟、脾臟、胸腺。將血液靜置后分離血清,分裝后低溫保存。內臟漂洗后,拭干,稱質量。取部分肝組織固定于甲醛溶液中,其余分裝后于-80 ℃環境保存。

1.5 指標檢測

1.5.1血清生化指標測定 麻醉大鼠后,經腹主動脈采血,收集血液。將收集的血液置于室溫靜置1 h,4 ℃, 3 000 r·min-1離心10 min,取上清液。采用賴氏法檢測血清AST、ALT、A/G、TP、T-BIL。采用ELISA法檢測HA、LN、ColⅢ、ColⅣ。

1.5.2肝組織病理檢查 肝組織經甲醛固定24 h后,常規脫水,石蠟包埋,切片,行HE和Masson染色。

1.5.3RT-PCR法檢測肝組織中α-SMA、ColI、TGF-β1、Smad7 mRNA的表達 按RT-PCR檢測試劑盒檢測肝臟組織中α-SMA,ColI、TGF-β1、Smad7 mRNA的表達。

1.5.4免疫組織化學法檢測肝臟組織相關蛋白表達 肝組織經甲醛固定24 h后,常規脫水,包埋,切片,烤片,靜置至室溫。按照免疫組化染色步驟滴加一抗(稀釋比例α-SMA、ColI、Smad2為1 ∶500,TGF-β1為1 ∶1 000、Smad7為1 ∶100),4 ℃孵育12 h,PBS沖洗3次后孵育二抗1.5 h(稀釋比例1 ∶5 000),PBS沖洗3次后染色,清洗后烘干即可封片。

1.5.5Western blot法檢測肝臟組織中TGF-β1,Smad4,Smad7蛋白表達 每組隨機取3個樣品肝組織適量,冰上研磨,制備10%肝組織液,分離后提取蛋白,備用。經制膠,電泳、轉膜、封閉、免疫反應(TGF-β 1稀釋比例1 ∶1 000,Smad4稀釋比例1 ∶1 000,Smad7稀釋比例1 ∶100),4 ℃孵育過夜,用5%脫脂牛奶稀釋二抗(稀釋比例1 ∶5 000),常溫孵育1 h,掃膜、密度分析。

2 結果

2.1 大鼠的一般情況大鼠適應性喂養期間,狀態良好,體質量增加。建立肝纖維化模型后,與正常對照組相比,模型組大鼠精神萎靡、反應遲鈍、毛發暗淡。給予DMDD治療后,與模型組相比,DMDD給藥組大鼠精神較活躍,活動較豐富,毛發光澤度更高。

2.2 血清生化指標結果由Tab 1可知,與正常對照組相比,模型組大鼠肝臟AST、ALT、TP、T-BIL明顯升高(P<0.01),A/G明顯降低(P<0.01)。與模型組對比,DMDD給藥組AST、ALT、TP、T-BIL明顯降低(P<0.01或P<0.05),A/G明顯升高(P<0.01或P<0.05),差異具有統計學意義。

Tab 1 Effects of DMDD on ALT, AST, A/G, TP, T-BIL n=10)

2.3 血清HA、LN、ColⅢ、ColⅣ水平的影響由Tab 2可知,與正常對照組相比,模型組HA、LN、ColⅢ、ColⅣ水平明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.01)。與模型組相比,DMDD給藥組HA、LN、ColⅢ、ColⅣ水平明顯下降,差異具有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。

Tab 2 Effects of DMDD on HA, LN, ColⅢ、ColⅣ n=10)

2.4 肝臟組織病理檢測和Masson染色結果Fig 1為肝臟病理HE和Masson染色結果,正常組大鼠肝細胞排列整齊,肝索呈星狀排列,肝小葉結構完整,肝竇周圍無充血、出血、水腫現象,肝間質無炎癥細胞浸潤,匯管區無纖維組織增生。模型組大鼠肝小葉結構損壞明顯或消失,肝索排列紊亂,肝細胞腫脹、空泡氣球樣變型、壞死、結構紊亂。匯管區及中央靜脈區纖維結締增生明顯,條索粗大,相互連接成為纖維間隔。肝小葉不同程度壞死,伴隨炎癥細胞浸潤。DMDD給藥組大鼠肝纖維結締增生明顯減少,纖維條索明顯變窄,纖維間隔較少。肝細胞水腫明顯好轉,炎癥浸潤明顯減輕,排列較整齊,結構無明顯改變。肝小葉結構較完整,肝索排列較為整齊。

Fig 1 HE staining and Masson staining of liver tissue(×200, 50 μm)

2.5 肝臟中α-SMA、ColI、TGF-β1、Smad7 mRNA水平由Tab 3可知,與正常對照組相比,模型組大鼠α-SMA、ColI、TGF-β1 mRNA含量明顯升高,Smad7含量明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.01)。與模型對照組相比,DMDD給藥組大鼠α-SMA、ColI、TGF-β1 mRNA含量變化明顯下調,Smad7含量明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。

Tab 3 Effect of DMDD on α-SMA, ColI, TGF-β1, Smad7 mRNA

2.6 肝臟組織中α-SMA,ColI,TGF-β 1、Smad2、Smad7蛋白表達結果由Fig 2可知,肝臟中α-SMA、Smad2的陽性表達主要位于間質細胞,ColI、TGF-β1陽性表達主要位于胞漿中,Smad7的陽性表達位于胞核。與正常對照組相比,模型組α-SMA、ColI、TGF-β1、Smad2陽性表達量明顯增多,Smad7陽性表達含量明顯減少。與模型組相比,DMDD給藥組α-SMA、ColI、TGF-β1、Smad2陽性表達明顯減少,Smad7陽性表達含量明顯增多。

Fig 2 Effects of DMDD on expression and histologic localization of hepatic fibrosis-related factorsof liver in rats administered with CCl4(×400, 100 μm)

2.7 肝臟組織中TGF-β1,Smad4,Smad7蛋白表達情況由Fig 3可知模型組大鼠肝臟組織中TGF-β1、Smad4蛋白水平較正常組明顯升高,Smad7蛋白水平明顯下降(P<0.01或P<0.05)。DMDD干預后,以上3項指標發生反向改變,即TGF-β1、Smad4蛋白水平下調,Smad7蛋白水平上調(P<0.01或P<0.05)。

Fig 3 Effects of DMDD administration on protein expression of TGF-β1, Smad4, Smad7 of liver in rats administered with

3 討論

CCl4具有明顯的肝毒性,連續間斷反復刺激可引起肝纖維化,具備造模率高的特點[9]。肝臟損傷后,肝細胞破裂,胞內各種酶釋放到血液中,以AST、ALT變化最為明顯[10]。所以常以AST、ALT水平評價肝臟損傷程度。肝臟組織HE染色和Masson染色為被認為是鑒定肝纖維化和纖維化分級的金指標,通過染色結果可觀察到肝纖維化肝臟內細胞排列紊亂,肝小葉及肝竇損壞消失,纖維結締增生明顯[11]。實驗結果表明,模型組大鼠血清AST、ALT明顯升高,病理染色可見大量纖維結締組織生成,纖維橋形成,說明造模成功。DMDD給藥組大鼠血清中AST、ALT水平明顯降低,肝臟病理檢測結果顯示纖維結締增生明顯減少,肝細胞排列較為整齊,炎癥浸潤明顯減少。

正常肝臟內細胞外基質(extra cellular matrix, ECM)的沉積與降解處于動態平衡。當肝纖維化發生時,ECM的合成增多,降解減少,導致肝臟內ECM的沉積與降解失去平衡,大量ECM沉積于肝臟中,最終形成肝纖維化[12]。ECM的組成包括纖維和基質,基質有LN、HA,纖維主要是膠原纖維。目前已知在肝纖維化發生過程中主要的膠原纖維有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型,其中Ⅰ型最常見,占成纖維細胞合成膠原約80%[13]。在模型組中,可發現LN、HA、ColI、ColⅢ、ColⅣ水平明顯升高,說明在肝纖維化形成過程中,上述物質大量存在。DMDD給藥干預組大鼠血清及肝臟中LN、HA、ColI、ColⅢ、ColⅣ明顯下調,說明對于CCl4誘導的肝纖維化具有逆轉的作用。

肝纖維化形成過程中有多種細胞因子參與,其中以TGF-β1最為重要,是目前已知最強的致肝纖維化的細胞因子[14-15]。TGF-β1通過結合肝細胞表面的相應受體,調控Smads蛋白轉導通路,誘導細胞凋亡,增加ECM合成,抑制ECM降解等,使肝纖維化加劇[16]。Smads蛋白家族是TGF-β信號通路的關鍵傳導分子,受體調控型Smad(R-Smad)2、3介導TGF-β信號傳導,通用型Smad(Co-Smad)4是TGF-β信號傳導的必需分子,抑制型Smad(I-Smad)7抑制TGF-β信號傳導[17]。因此阻斷TGF-β1/Smads信號通路不僅能減少ECM的形成,同時能降低肝纖維化的程度。在模型組中可見TGF-β1、Smad2、4蛋白表達水平明顯提高,而Smad7蛋白表達水平明顯降低,DMDD給藥干預后上述指標明顯得到逆轉,說明其可能通過干預TGF-β1/Smads信號通路干預肝纖維化的病情進展。

DMDD高、低劑量組抗肝纖維化的作用結果相差不大,提示其抗肝纖維化作用與劑量梯度關系不明顯。秋水仙堿能抑制肝纖維化過程中纖維的增生,而肝纖維化的發生受到TGF-β1/Smads信號通路的調控,其可能也通過調控TGF-β1/Smads信號通路參與抗肝纖維化過程。

綜上所述,DMDD對CCl4誘導的肝纖維化具有改善作用,可能與其調控TGF-β1/Smads信號通路有關。