一株茶毒蛾病原細菌的分離、鑒定及致病性測定

張倪銘, 陳李林, 倪德芳, 李文凱, 童應華

(1.福建農林大學林學院;2.福建農林大學植物保護學院,福建 福州 350002)

茶毒蛾(EuproctispseudoconspersaStrand),隸屬鱗翅目(Lepidoptera)毒蛾科(Lymantriidae)黃毒蛾屬(EuproctisHübner),又稱茶毛蟲、茶黃毒蛾、油茶毒蛾、擺頭蟲等[1],是山茶屬植物的重要害蟲,主要為害油茶(CamelliaoleiferaAbel)、茶[C.sinensis(L.) O. Kuntze][2],分布于我國福建、江西等省及日本[1,3]、朝鮮[4]、越南[1]、印度[1]等國。該蟲在福建一年發生3～4代[5],以卵塊附著于下部葉片背面越冬[1,6],幼蟲取食油茶或茶樹嫩梢[3,5,7];寄主受害后,嫩梢呈焦枯狀,樹勢減弱,油茶茶籽產量降低[2],連年遭害將死亡[8]。

目前,對茶毒蛾的種群控制以噴霧[8]、煙劑[9]等化學防治為主,輔以人工摘除幼蟲和卵塊[2]、清除枯葉和雜草[2]、墾復[2]及燈光誘殺[7-8]等物理防治。在生物防治方面:李秋玲[7]和包強等[10]研究表明,濃度為1.0×108個·mL-1的白僵菌孢子懸浮液對茶毒蛾幼蟲的防治效果較好;劉元兵[11]和林曦碧[12]研究發現,多個球孢白僵菌菌株對茶毒蛾有較高致病力;另外,有學者研究了茶毛蟲核型多角體病毒(E.pseudoconsperanuclear polyhedrosis virus, EpNPV)[13]、茶毛蟲布尼亞病毒(E.pseudoconsperabunyavirus, EpBYV)[14-15]、性引誘劑[4,16-18]、捕食性天敵[1,19]和寄生性天敵[3,20]等對該蟲的防治效果。蘇云金芽孢桿菌(BacillusthuringiensisBerliner, Bt)用于防治茶毒蛾的歷史較久[21],是目前使用最廣泛的病原細菌[22]。林間噴施Bt和殺螟桿菌(B.cereusFrankland)防治茶毒蛾3齡以下幼蟲,防治率達80.00%以上[2,7]。此外,Bt對EpNPV有增效作用[23],EpNPV-Bt混劑對茶毒蛾幼蟲有較好的田間防治效果[24-25]。

茶毒蛾幼蟲易發生細菌性軟腐病[1],且該蟲具有群聚取食的習性[6],有利于病原細菌的傳播、擴散而誘發流行病。但有關茶毒蛾病原細菌的分離、鑒定及致病力少有報道。本研究從茶毒蛾病死幼蟲蟲體上分離得到一株病原細菌,通過室內測定評價其對茶毒蛾的致病性,為茶毒蛾的生物防治提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 菌種的分離、純化

1.1.1 病死蟲處理與病原細菌的分離、純化 自然感染細菌的茶毒蛾病死幼蟲采自福建省屏南縣棠口鄉安溪村茶園(26.969°N、118.972°E),寄主為茶。以75%(體積分數)酒精擦拭蟲體表面,無菌操作下,用無菌接種環刮取病蟲腹部末端流出的體液,適當稀釋于無菌水中,涂布于NA平板培養基(蛋白胨10 g,NaCl 5 g,牛肉膏3 g,瓊脂20 g,加水至1 L)上,置于33 ℃恒溫培養箱中倒置培養。2 d后,采用4區劃線法[26],3次劃線分離,直至用Nikon E100光學顯微鏡觀察到單一菌種,命名為Nan-Y。

1.1.2 回接感染試驗 采用喂食法進行回接感染試驗。于NA平板培養基上培養Nan-Y菌株2 d后,用無菌水將菌落洗至無菌三角瓶(100 mL)中。將新鮮茶樹嫩葉浸泡于菌液中,20 s后取出,飼喂健康茶毒蛾幼蟲,觀察幼蟲的感染癥狀,并從死亡蟲體分離、純化病原菌,觀察菌體與菌落特征是否與原病原菌相同。

1.2 病原細菌的形態觀察

將Nan-Y菌株接種于NA平板培養基上,于33 ℃恒溫培養箱中倒置培養。觀察、記錄菌落形態、顏色、生長狀況等,以革蘭氏染色法[27]將菌體染色后,在Nikon E100光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 病原細菌的分子鑒定

1.3.1 細菌DNA提取與16S rDNA序列擴增 將Nan-Y菌株接種于液體NA培養基搖瓶中,33 ℃、110 r·min-1培養12 h,以離心柱法提取DNA。采用細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492R(5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。

PCR(20 μL)反應體系:10×ExTaqbuffer 2.0 μL,5 U ExTaq0.2 μL,2.5 mmol·L-1dNTP Mix 1.6 μL,27F/ITS1 1.0 μL,1492R/ITS4 1.0 μL,DNA 0.5 μL,ddH2O 13.7 μL。

PCR反應程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30個循環;72 ℃補充延伸10 min。取擴增產物5 μL經0.8%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳,成像系統成像[28]。

1.3.2 PCR產物測序分析 江西師范大學國家科技園對PCR擴增產物進行測序。在NCBI數據庫中對序列結果進行Blast同源性比對。采用MEGA 7.0軟件,通過Clustal W方法對分子鑒定結果進行序列分析,構建分子系統發育樹[29]。

1.4 病原細菌對茶毒蛾的致病性測定

1.4.1 供試蟲飼養 供試茶毒蛾幼蟲采自福建省屏南縣棠口鄉安溪村茶園(26.969°N、118.972°E)。將采集的幼蟲放入方形塑料盒(15 cm×10 cm×10 cm)中,置于溫度(25±1) ℃、相對濕度70%、光周期(L∶D)14 h∶10 h的養蟲室內,飼喂新鮮茶樹嫩葉。

1.4.2 致病力測定 將Nan-Y菌株接種至NA平板培養基上,活化48 h后,用無菌水洗至無菌三角瓶(100 mL)中,SHA-C振蕩器振蕩10 min(150 r·min-1)。在無菌條件下,將菌懸液分別稀釋10、102、103、104、105倍,取各濃度菌液1 μL,均勻涂布于NA固體培養基上。于28 ℃恒溫培養箱倒置培養1 d后,將培養基平板上的菌落數乘以稀釋倍數,取平均值,得到原液濃度。用無菌水將原液配制成(1.0±0.5)×1010、(1.0±0.5)×1011、(1.0±0.5)×1012、(1.0±0.5)×1013、(1.0±0.5)×1014cfu·mL-1共5種濃度的菌懸液。將新鮮茶樹嫩葉浸泡于菌懸液中20 s后放入培養皿(D=15 cm)中,每個培養皿放入5片大小相對一致的葉片。選擇大小基本一致的4齡健康茶毒蛾幼蟲放入培養皿中飼喂,以浸無菌水的脫脂棉保濕,置于溫度(25±1) ℃、相對濕度80%的人工氣候箱內飼養。每種濃度為1個處理,每個處理5個重復,每個重復20頭幼蟲,以飼喂浸無菌水的茶樹嫩葉為對照。每天定時觀察、記錄各處理幼蟲的感染情況,輕觸蟲體不動視為死亡,以蟲體軟腐為有效致死。

1.5 數據處理與分析

用Excel 2016軟件處理試驗數據。用SPSS Statistics 22.0軟件[30]對致死中時(LT50)和致死中濃度(LC50)進行Probit回歸分析,并對死亡率進行Duncan′s新復極差法多重比較。

2 結果與分析

2.1 病原細菌的形態特征

經分離、純化得到細菌Nan-Y。在NA培養基上33 ℃培養7 d后,菌落呈較小的淡黃色不規則點狀,黏稠,表面微隆起,邊緣較整齊(圖1)。菌體桿狀,分散排列,革蘭氏染色呈紅色,為革蘭氏陰性菌(圖2)?；亟痈腥驹囼灲Y果表明,茶毒蛾幼蟲的感染癥狀與原始癥狀一致,從死亡蟲體上分離、純化的菌株的菌體、菌落特征與原菌株相同。由此可知,Nan-Y為茶毒蛾幼蟲軟腐病的病原細菌。

圖1 Nan-Y菌株的菌落特征(33 ℃, 7 d)Fig.1 Colony characteristics of strain Nan-Y(33 ℃, 7 d)

2.2 16S rDNA分子鑒定結果

通過NCBI數據庫進行Blast同源性比對,發現Nan-Y菌株的16S rDNA序列與不解糖假蒼白桿菌(Pseudochrobactrumasacchrolyticum)菌株CCUG 46016(編號NR 042474.1)相應序列的一致性達99.71%。利用MEGA 7.0軟件進行序列匹配排列,并構建系統發育樹(圖3),確定Nan-Y菌株為不解糖假蒼白桿菌。

圖3 菌株Nan-Y和假蒼白桿菌屬菌種的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain Nan-Y and Pseudochrobactrum sp.

2.3 Nan-Y菌株對茶毒蛾幼蟲的致病性

2.3.1 茶毒蛾幼蟲的感染癥狀與累計死亡動態 健康茶毒蛾4齡幼蟲形態特征如圖4A所示。取食浸泡過(1.0±0.5)×1012cfu·mL-1菌懸液的茶樹嫩葉1 d后,部分茶毒蛾幼蟲出現行動遲緩、痙攣、食欲減退、排軟便等現象,有的甚至死亡。初死幼蟲蟲體失去光澤,軟化,具膿狀,之后體色逐漸加深至橙紅色(圖4B);死亡2 d后體色轉為紅棕色,體壁破裂流膿,伴有臭味;后期體色持續加深至黑褐色,蟲體腐爛,內部組織潰爛、粘連;5 d后膿液流盡,僅余表皮(圖4C)。

A.健康幼蟲;B.感染初期;C.感染后期。

以不同濃度Nan-Y菌懸液處理2 d后,幼蟲累計死亡率顯著升高;處理6 d后,最低濃度[(1.0±0.5)×1010cfu·mL-1]處理下幼蟲累計死亡率為61.00%,最高濃度[(1.0±0.5)×1014cfu·mL-1]處理下累計死亡率達100.00%(圖5)。

圖中不同大、小寫字母分別表示經Duncan′s新復極差法檢驗,同一時間點不同處理間在0.01和0.05水平上差異顯著。

2.3.2 Nan-Y對茶毒蛾幼蟲的LT50茶毒蛾幼蟲經不同濃度菌懸液處理后,死亡率差異較大。(1.0±0.5)×1014cfu·mL-1菌懸液處理3 d后,茶毒蛾幼蟲的累計死亡率為68.00%,極顯著高于其他濃度處理(P<0.01);(1.0±0.5)×1013、(1.0±0.5)×1014cfu·mL-1菌懸液處理6 d后,茶毒蛾幼蟲的累計死亡率分別達96.00%和100.00%,極顯著高于其他3種濃度處理(P<0.01),LT50也較短,分別為3.24、2.11 d;最低濃度 [(1.0±0.5)×1010cfu·mL-1]處理6 d后,茶毒蛾幼蟲的累計死亡率為61.00%,LT50為5.47 d(表1)?？梢?Nan-Y對茶毒蛾幼蟲有較強的致病性。

表1 不同濃度Nan-Y菌懸液對茶毒蛾4齡幼蟲的致死效果1)Table 1 Lethal effect of bacterial suspension of strain Nan-Y with different concentrations on E.pseudoconspersa 4th instar larvae

2.3.3 Nan-Y對茶毒蛾幼蟲的LC50從表2可知,隨著菌懸液濃度增大,茶毒蛾幼蟲的死亡率不斷升高。Nan-Y菌懸液處理茶毒蛾幼蟲3、6 d的LC50分別為5.23×1013、3.04×109cfu·mL-1,LC90分別為9.21×1015、7.17×1012cfu·mL-1。

表2 不同濃度Nan-Y菌懸液在不同時間對茶毒蛾4齡幼蟲的致死效果1)Table 2 Lethal effect of bacterial suspension of strain Nan-Y with different concentrations on E.pseudoconspersa 4th instar larvae at different time

3 討論

目前,國內外有大量應用昆蟲病原細菌防治害蟲的成功案例。昆蟲病原細菌可研發制成微生物制劑,其具有防效良好、不易產生“3R”問題等優點[31],在防治害蟲方面起著重要作用。有關茶毒蛾病原細菌的研究已取得一定進展。例如:黃健屏等[32]用5株Bt菌株對茶毒蛾進行田間防治,發現噴灑1.0×108cfu·mL-1菌懸液7 d后,3齡幼蟲死亡率為52.90%～99.10%,致死高峰在2～5 d;將1.0×108cfu·mL-1殺螟桿菌用于田間防治,茶毒蛾1、2齡幼蟲的蟲口減退率為84.10%[8];將16 000 IU·mg-1Bt可濕性粉劑稀釋1 500倍用于防治茶毒蛾低齡幼蟲,7 d后的防效為77.88%[25]。本試驗從自然染菌的茶毒蛾病死蟲體上分離得到一株病原細菌Nan-Y,為革蘭氏陰性菌,菌體桿狀,在33 ℃條件下于NA固體培養基上培養,其菌落較小,呈淡黃色不規則點狀,黏稠,表面微隆起,邊緣較整齊。經形態觀察和分子鑒定,確定其為不解糖假蒼白桿菌。經室內測定,Nan-Y對茶毒蛾幼蟲有較強致病性,(1.0±0.5)×1013、(1.0±0.5)×1014cfu·mL-1菌懸液處理6 d后,茶毒蛾幼蟲的校正死亡率分別達95.49%和100.00%。

不解糖假蒼白桿菌屬于假蒼白桿菌屬,為異養細菌,需氧,氧化酶反應陰性,接觸酶反應弱陽性[33]。有關其對昆蟲的致病性研究較罕見。Jiménez-corté et al[34]研究表明,不解糖假蒼白桿菌對大蠟螟(Galleriamellonella)無致病性。目前,該菌主要用于治理重金屬污染土壤[35-36],經發酵培養后還可作為催化劑提高對甲霜靈的回收率[37],且該菌對何首烏種子萌發有促進作用[38]。Robert et al[39]研究發現,不解糖假蒼白桿菌對洋蔥土傳病原菌有生防潛力。本研究首次發現不解糖假蒼白桿菌對茶毒蛾幼蟲有較強的致病性。

病原細菌主要以3種方式侵入昆蟲體內:自然孔口(如口腔、肛門、氣門等)直接侵入、通過傷口間接侵入,以及通過線蟲等媒介經昆蟲口腔或傷口侵入[40-41]。病原細菌侵入寄主體內后,在其體內增殖,產生毒素、溶血素、蛋白酶、酯酶和對昆蟲有毒害作用的次生代謝產物等,導致昆蟲代謝體系紊亂,引發敗血癥,最終死亡[42-44]。但昆蟲病原細菌細胞壁薄,易受溫度、濕度和紫外光等環境因素的影響[45]。因此,有關不解糖假蒼白桿菌Nan-Y對茶毒蛾的致病機理、致病條件、田間應用效果和安全性還需進一步研究。