基于全細胞生物傳感器的污染物生物有效性評估研究進展

谷彩文, 朱 一, 林 瀚, 張小凱, 王震宇

(江南大學環境與生態學院,江蘇 無錫 214122)

近幾十年來,自然資源的過度開發、生活和生產污染物的不合理處置導致各類環境污染問題頻發。研究表明,全球已有超過14%的淡水徑流被污染,污水總量超5.5億t[1-2]。同時,大量的工業、農業、生活污水直接排入土壤,破壞土壤結構,影響微生物種群分布;作物積累的重金屬等有害物質通過生物放大效應危害人體健康[3-4]。此外,調查顯示,人口聚集地的大氣污染水平遠高于世界衛生組織所制訂的空氣質量標準[5]。因此,開展環境中污染物的檢測和風險評估工作對人類健康發展和生態保護至關重要。

污染物濃度是研究污染物對生態系統和人體健康影響的重要指標,常用的檢測方法包括電化學法、色譜法、原子光譜法、熒光法和比色法等[6-7]。這些化學方法適用于不同類型的污染物,可以有效地分析樣品中污染物的總濃度。然而,污染物的總濃度并不能完全代表其對環境的毒害作用,無法有效反映污染物的生物毒性[8-10]。研究表明,生物有效性是判斷污染物毒害大小的先決條件[11]。Wells et al[12]認為“沒有生物有效性即沒有生物毒性”。因此,在進行環境風險評估時,污染物的生物有效性是很重要的評估指標之一。

近年來,全細胞生物傳感器在污染物生物有效性評估方面表現出了卓越的性能,在環境風險評估方面具有非凡的應用潛力[13]。全細胞生物傳感器是基于基因工程的產物,能對環境中的目標化學物質做出感應,并產生可被檢測的電化學或光學信號[14],通過信號的強弱判斷環境中污染物的生物有效性。本文簡要介紹全細胞生物傳感器的分類、工作原理及其構建因素,重點闡述其在環境領域的應用,為推動該技術的商業化應用提供理論依據。

1 全細胞生物傳感器的分類及工作原理

全細胞生物傳感器通常以細菌為宿主菌株,利用一種或多種調控基因和報告基因產生一種可識別量化的信號[15]。圖1為全細胞生物傳感器檢測環境中污染物生物有效性的工作機理。根據指示物被識別方式、信號轉化及處理機制,全細胞生物傳感器可以分為3大類:Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類[16]。Ⅰ類全細胞生物傳感器為目標特異性全細胞生物傳感器,參與特定遺傳調控機制的啟動子識別污染物后,通過報告基因的表達輸出信號,從而檢測特定污染物的生物有效性[17]。Ⅱ類全細胞生物傳感器是應激特異性全細胞生物傳感器,當感知到壓力脅迫(如DNA損傷、蛋白質損傷、熱休克)時,表現為信號輸出[17]。該類全細胞生物傳感器并不能區分是何種污染物造成的環境壓力,因此其可被用于檢測多重污染產生的環境風險。Ⅲ類全細胞生物傳感器為非特異性全細胞生物傳感器,通常由無毒環境中信號表達水平較高的細胞構建,當其暴露于存在有毒化學物質的環境中時,報告基因的表達被抑制,信號輸出減弱[18-19]。這類全細胞生物傳感器主要用于檢測污染物的毒性。相比之下,Ⅰ類全細胞生物傳感器的應用是最廣泛的[20-23],下文將對其進行闡述。

圖1 全細胞生物傳感器工作原理示意圖Fig.1 Diagram of sensing mechanism of whole-cell bioreporters

2 全細胞生物傳感器的構建

2.1 調控基因

調控基因和報告基因是全細胞生物傳感器遺傳回路編碼的重要組成部分,這兩類基因在質粒上的融合是全細胞生物傳感器構建的基礎。全細胞生物傳感器的性能主要取決于調控基因對待測物的響應效果。當感知到目標化合物或應激因子時,全細胞生物傳感器中的轉錄調控因子會刺激調控基因做出響應,誘導報告基因的轉錄并改變輸出信號[24]。

調控蛋白的主要工作機制涉及能夠識別同族化學物質的效應物的結合反應[25]。調控蛋白與操縱子特異性結合阻止或啟動調控基因的轉錄,當感知到環境中的特定污染物時,效應物作用于調控蛋白,變構的調控蛋白與操縱子的結合狀態發生變化,從而調控報告基因的表達[26]。例如:砷酸鹽全細胞生物傳感器中的調控蛋白ArsR,在沒有砷酸鹽存在的情況下可與ars操縱子相結合,并阻止其自身和下游ars基因的表達;而當環境中存在砷酸鹽時,它會進入細胞內與ArsR蛋白相互作用,導致ArsR蛋白與操縱子相分離,使得ars基因能夠表達并調控報告基因使其產生熒光信號[27]。

在某些情況下,具有相似結構的效應物能引起同一種調控蛋白的響應,如對苯產生響應的XylR蛋白也能與甲苯、二甲苯發生反應[28],對萘產生響應的phnR蛋白也能與菲發生反應[29]。

學者們通過大量的研究不斷探索全細胞生物傳感器構建的分子機制,并將其與合成生物學相結合[30],極大地促進了該技術的發展。例如,在細胞內插入融合好的基因已被證明可以有效地提高生物傳感器的特異性,這些基因不僅能夠整合多個信號的輸入,也能合理地調整細胞內受體蛋白的水平,進而大大改善了全細胞生物傳感器的檢測極限[31]。Turner et al[32]將融合好的hbpCp-luxAB基因插入大腸桿菌(Escherichiacoli)中所構成的全細胞生物傳感器,能夠對羥基化聯苯保持較高的特異性檢測水平,而cadCp-lucFF基因能夠操控全細胞生物傳感器,同時可對鋅、鉛、鎘等多種重金屬產生響應[33]。

2.2 報告基因

當全細胞生物傳感器暴露于目標物質中時,報告基因在調控基因的誘導下表達并產生可測量的信號。報告基因在信號傳導過程中起著重要作用,其中應用最廣泛的有β-半乳糖苷酶(lacZ)、熒光素酶(lux)和綠色熒光蛋白(gfp)3種基因[34]。

研究發現,lacZ基因相對比較穩定,當X-gal(lacZ的顯色底物)作為水解底物時,lacZ能催化生成便于光學檢測的藍色產物[35-36]。當以對氨基苯基-β-D-半乳糖苷(4-aminophenyl-beta-D-galactopyranoside)為底物時,通過電化學方法可以檢測酶解產生的對氨基酚(4-aminophenol)的量,從而確定lacZ的表達情況[37]。研究人員通過將lacZ基因與DNA損傷應答基因(recA)啟動子結合,開發出了一種可有效檢測環境中農藥(如毒死蜱、丙苯氧磷、氯氰菊酯)遺傳毒性的全細胞生物傳感器,其可用于環境中基因毒性物質的風險評估[38]。

具有特定發光效應的lux是另一種比較常見的用于構建全細胞生物傳感器報告系統的基因。Engebrecht et al[39]從弧菌(Vibriofurnissii)中分離出完整的lux(luxCDABE)基因,在此基礎上構建的重組大腸桿菌是在不添加醛的情況下可產生生物發光信號的全細胞生物傳感器。lux基因可在多種生物體中存在,如螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase)基因(由luc編碼)和海腎熒光素酶(sea pansy luciferase)基因(由ruc編碼)[40]?；趌ux基因構建的全細胞生物傳感器可以用于檢測多種污染物的生物有效性。例如:基于luxAB基因構建的全細胞生物傳感器可以有效檢測苯酚的生物有效性[41];基于luxCDABE基因構建的全細胞生物傳感器可以檢測水體中鉛的生物有效性,其檢測限低至1.2 μg·L-1[13]。

gfp基因最早是從水母(Aequoreavictoria)中分離得到的,具有體積小(238個氨基酸)、能夠在多種生物體內成功表達、無需任何外源底物或腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate)等特點,是目前最常用的報告基因[42]。然而,基于gfp的全細胞生物傳感器面臨著檢測背景信號強、對污染物的響應較慢[24]等問題。為了解決這些問題,采用具有優越穩定性且能夠發出更強熒光信號的增強型綠色熒光蛋白基因(egfp)是一個很好的選擇。Kang et al[43]將zntAp與egfp融合,在此基礎上構建的全細胞生物傳感器可以對鎘、汞、鋅做出響應。Kim et al[44]基于egfp構建的全細胞生物傳感器通過改變啟動子區域的氨基酸序列,改變對重金屬離子的選擇性,從而能夠檢測環境中存在的多種金屬離子。研究表明,以egfp作為報告基因的全細胞生物傳感器已逐漸成為檢測污染物生物有效性的重要工具[45-46]。

除了上述常用的報告基因外,還有一些基因也可被用作構建全細胞生物傳感器。如:Stenzler et al[47]基于黃素熒光基因(PpFbFP)構建的全細胞生物傳感器可在厭氧條件下檢測環境中汞的生物有效性;以參與類胡蘿卜素合成的crtA基因作為報告基因的全細胞生物傳感器可以對環境中較低濃度的亞砷酸鹽進行檢測[48]。

2.3 宿主菌株

在構建全細胞生物傳感器時,除了確定調控基因和報告基因外,宿主菌株的選擇也尤為重要[11]。全細胞生物傳感器通常以細菌作為宿主菌株,在不同污染物的刺激下,每個菌株的敏感性和響應度不同。因此,在實際檢測時,針對不同的目標污染物,需要選擇對其有特定抗性機制的生物作為宿主菌株[49]。

大腸桿菌已被廣泛用作全細胞生物傳感器的宿主菌株,用于檢測典型環境污染物(如重金屬和有機化合物)的遺傳毒性[50]。除大腸桿菌外,其他革蘭氏陰性細菌,如真氧產堿桿菌(Alcaligeneseutrophus)[51]和耐金屬貪銅菌(Cupriavidusmetallidurans)[52],以及革蘭氏陽性細菌,如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[53-54]也被廣泛用于全細胞生物傳感器的構建。Magrisso et al[52]以耐金屬貪銅菌為宿主菌株構建的全細胞生物傳感器可用于檢測土壤中多種重金屬的生物有效性;Kim et al[33]利用枯草芽孢桿菌構建的全細胞生物傳感器可對水環境中的鉛、鋅和錫等重金屬做出響應。此外,真菌、酵母菌和藻類[55-56]也可作為全細胞生物傳感器的宿主菌株。

3 全細胞生物傳感器的應用

3.1 重金屬檢測

重金屬由于具有較高的毒性、不可被降解和環境持久性等特點,對生態系統造成了巨大的威脅[57]。近年來,使用全細胞生物傳感器評估重金屬的生物有效性已經成為研究熱點[58-59]。表1總結了全細胞生物傳感器在重金屬生物有效性評估方面的應用。研究表明,基于不同宿主菌株構建的全細胞生物傳感器的靈敏度不同。例如:基于藍細菌(Cyanobacteria)構建的全細胞生物傳感器對砷的檢測限為11.24 mg·L-1[60];而基于大腸桿菌DH5α構建的全細胞生物傳感器對砷的檢測限低至微克每升的級別[61]。因此,可以根據環境中重金屬污染水平的差異選擇不同的全細胞生物傳感器進行生物有效性檢測。

表1 全細胞生物傳感器檢測重金屬生物有效性的相關研究1)Table 1 Recent studies on detection of heavy metal bioavailability by whole-cell biosensor

研究表明,重金屬(尤其是生物非必需金屬)在極低濃度下對大多數細菌都具有毒害作用[65]。因此,需要對全細胞生物傳感器進行優化以提高其在較高濃度重金屬環境下的檢測性能。研究人員發現,在細胞內加入解毒基因能夠增強其對重金屬的耐受性[21]。例如,zntA和cadA是兩個典型的金屬轉運蛋白編碼基因,可用于構建能夠在極端環境中工作的全細胞生物傳感器[66]。Zhang et al[67]研究表明,基于zntA構建的全細胞生物傳感器可以在1.2 μg·L-1～12.5 mg·L-1的質量濃度范圍內檢測鉛的生物有效性。

Li et al[59]研究發現,全細胞生物傳感器可以同時通過兩個模式檢測鉛的生物有效性和毒性,而其毒性的檢測是基于常規風險評估方法的生物配體模型。試驗條件(如pH、細胞密度和培養基成分)的細微差異可能會對全細胞生物傳感器的檢測限造成影響[13]。Delatour et al[68]發現,通過改變細胞培養液中的營養物質如葡萄糖和木糖中氨基酸的濃度,可以對全細胞生物傳感器的響應時間及生物發光信號的形態進行精細調整。特定的金屬結合蛋白也可顯著提高全細胞生物傳感器的選擇性和靈敏度。如全細胞生物傳感器可通過在大腸桿菌中融合可編碼調控蛋白MerR的汞抗性基因和啟動子mer提高對汞的選擇性[22]。此外,將全細胞生物傳感器與基因信號放大器耦聯也是一種比較常見的優化方式,在細胞內添加放大器有利于熒光響應信號的輸出,進而提高全細胞生物傳感器的靈敏度和特異性。研究表明,添加了“T7-RNA 聚合酶”放大器的全細胞生物傳感器對鎘離子響應的速度及特異性明顯提高[69]。

3.2 有機污染物檢測

有機污染物可以通過多種方式進入環境中,如未經處理的工業或生活污水的直接排放、船舶或海上勘探造成的石油泄漏,以及殺蟲劑等污染物滲入土壤等[70]。研究人員通過構建不同的全細胞生物傳感器,分別對苯酚、阿莫西林、氯仿等多種有機污染物的生物有效性進行了評估[71-73]。表2總結了應用全細胞生物傳感器檢測有機污染物生物有效性的相關研究。

Patel et al[81]發現,全細胞生物傳感器對工業廢水樣品中的多種芳香烴化合物具有高靈敏性,檢測限在0.1～1.0 μmol·L-1。為了維持全細胞生物傳感器在復雜環境下檢測的穩定性,研究人員用聚多巴胺包裹細胞,使得檢測結果更加準確、有效,該傳感器可用于檢測土壤中的甲苯等有機物[82]?？股厥且环N新型有機污染物,其大量使用對環境造成了潛在的威脅。已有研究表明,以抗生素抗性基因啟動子與報告基因融合構建的全細胞生物傳感器可以用于評估抗生素在環境中的毒害作用[73]。

全細胞生物傳感器對不同的有機污染物具有不同的敏感性,這一特性使其可被用于單種或混合有機污染物遺傳毒性的高通量篩選[71]。自然環境條件會影響菌株的活性,進而影響全細胞生物傳感器的檢測結果。Plotnikova et al[82]對比了不同環境條件下全細胞生物傳感器對萘生物有效性的最低檢測限,結果表明,在氣相中最低檢測限為50 nmol·L-1,在水相中為0.5 μmol·L-1。萘的高揮發性是導致差異的主要原因。Zhang et al[83]研究了pH值對全細胞生物傳感器檢測性能的影響,發現pH值較高時宿主細胞可在鉛濃度較低的情況下表現出毒性反應。這是因為pH值會影響宿主細胞的活性,進而影響全細胞生物傳感器的檢測結果。因此,如何克服環境因素的影響是發展該技術的關鍵。Hurtado-Gallego et al[84]研究表明,以藍細菌作為宿主細胞的全細胞生物傳感器可以有效檢測污染源附近被污染的自然水體中污染物的生物有效性。藍藻細胞易于培養,且具有較強的環境適應性,使其能夠在更惡劣的環境條件下保持自身的活性。這說明宿主細胞對全細胞生物傳感器的重要性。此外,全細胞生物傳感器對實驗室中標準檢測物質的檢測結果并不能完全代表該物質在自然環境下的生物有效性。例如,使用全細胞生物傳感器對H2O2生物有效性進行檢測時,自然環境中產生的甲基紫精的O2-會干擾檢測的準確性,無法保證其特異性[85]。因此,如何保證全細胞生物傳感器在自然環境下對污染物的檢測性能值得重視。目前,研究人員已提出了解決方案,包括冷凍干燥、真空干燥、連續培養和固定在有機或無機源的生物相容性聚合物中[86-87]。將全細胞生物傳感器封裝在天然或合成聚合物中已被證明可用于檢測環境污染物,聚合物基質提供了一個水合環境,其中包含細胞所需的營養物質及細胞活性和生長的輔助因子,被包裹的宿主細胞在環境中能免受有毒物質的侵害,并保持質粒的穩定性[88]。

4 總結

與傳統方法相比,全細胞生物傳感器具有快速、經濟、操作簡便等優點,是檢測環境中污染物生物有效性的理想工具。然而,對于該技術的應用仍有幾個問題需要解決,包括進一步縮短響應時間、提高細胞靈敏度和選擇性,以及進一步推進其標準化應用等。未來應通過建立并完善全細胞生物傳感器的標準檢測方法,促進其商業化應用。