蘋果汁的酶促褐變抑制方法

邢楓，張蕙銘，王美淇，夏偉良，金鐵巖

延邊大學農學院 （延吉133002）

蘋果（Malusdomestica）由于其美味和優良的營養價值，已成為世界上種植和售賣量最廣泛的水果之一[1]。蘋果含有生物活性成分，尤其是酚類化合物，包括羥基苯甲酸、羥基肉桂酸、黃烷醇、黃酮醇、二氫查耳酮和花青素，它們有助于健康，例如抗氧化活性、抗炎活性、降膽固醇作用、心血管保護作用、抗糖尿病活性和抗癌活性。

研究表明，消費者對健康食品的興趣日益濃厚，趨向于食用營養價值高、加工最少且不含合成添加劑的新鮮食品。酶促褐變是加工食品中的主要問題之一，例如鮮切水果（蘋果、桃子、梨、香蕉、鱷梨等）和蔬菜（生菜、土豆、茄子等）、果汁等。它是由兩種重要的酶引起的，即多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）。大約50%的新鮮水果損失是由酶促褐變引起的，它不僅會產生不良的棕色，還會降低水果的營養質量和感官特性。因此，研究人員和食品行業最近一直在研究最合適的程序，以最大限度地減少加工水果的酶促褐變[2]。食品的顏色外觀是消費者在選擇過程中考慮的指標之一[3]。食品褐變反應的發生通常會損害食品的顏色外觀，并顯著降低客戶對產品的接受度[4]?？茖W家和食品技術專家因褐變效應對水果和蔬菜帶來的長期影響表示擔憂，這可能會影響一個國家的經濟狀況。

水果和蔬菜中發生的色素沉著過程可以是酶促褐變或非酶促褐變，具體取決于機制。非酶促褐變是指在食品中產生棕色色素沉著而不涉及任何酶活性的過程，并且與化學反應有關，例如美拉德反應、焦糖化和抗壞血酸褐變反應。新鮮水果或蔬菜的自然褐變是通過酶促褐變機制發生的。一個主要問題是酶促褐變，因為需要食物中存在的酶的作用和氧化才能發生[3]。水果和蔬菜的酶促褐變是不可取的，并且對食品生產商和食品加工業造成重大經濟損失，因為該過程主要發生在收獲后的處理、運輸、儲存和加工過程中。因此，酶促褐變不僅影響顏色變化，還導致營養和感官損失，導致適銷性降低和消費者接受度降低。因此，酶促褐變的發展可能導致超過50%的易褐變食物被浪費。

酶促褐變反應主要由PPO或其他酶如過氧化物酶（POD）和酪氨酸酶引起[5]。在氧氣存在下，當這些酶催化酚氧化為醌時，會發生酶促褐變。隨后，這些醌與其他化合物反應并聚合成稱為黑色素的棕色色素。然而，這種反應不會發生在新鮮水果和蔬菜中，因為它們的酶通過細胞區室與底物和酚類化合物分離。這可以解釋機械損傷和組織損傷，這些損傷會降低植物細胞的膜完整性，從而導致產生的棕色改變。這種反應可以通過去除水果和蔬菜切割表面的氧氣來防止。盡管如此，當氧氣重新建立時，褐變可以恢復。因此，利用抗氧化劑和褐變抑制劑滅活導致褐變的酶在食品工業中被廣泛應用，尤其是鮮切工業。為了控制鮮切食品中的褐變效應，抗壞血酸及其衍生物等抗氧化溶液因其還原特性而傳統地被采用。盡管如此，它的效果還是不太好，而且往往是暫時的?？紤]到這一點，食品加工業非常需要從天然來源中尋找具有抗褐變特性的新型食品添加劑，這些添加劑沒有任何有害的副作用[6]。

目前延邊州的蘋果產業價值不高，琿春市人民政府高度重視蘋果產業的發展，蘋果種植、加工產業已經成為延邊州重點支柱產業來發展區域經濟、實施鄉村振興戰略。延邊州蘋果產業只有提高蘋果深加工技術，加大研究深度，才能增加價值，為延邊州經濟發展做出貢獻。

試驗以延邊朝鮮族自治州琿春市富硒蘋果為原料進行單因素試驗，通過對蘋果汁進行水浴加熱、添加不同濃度的抗壞血酸和不同量的硫代硫酸鈉，并測定經過處理的蘋果汁的色度、褐變率、多酚氧化酶活性和總酚含量，找出最適宜的方法抑制酶促褐變，加快延邊蘋果產業發展，提高蘋果的經濟效益[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蘋果（吉林省延邊朝鮮族自治州琿春市，板石鎮孟嶺村的富硒蘋果）；鄰苯二酚溶液（麥克林）；0.01 mol/L碘酸鉀溶液（福林）；pH 6.4磷酸緩沖液（福林）；0.04 mol/L抗壞血酸溶液（科密歐）；5.5%偏磷酸溶液（福林）；0.5%可溶性淀粉（科密歐）。

1.1.2 主要儀器與設備

CM-5型分光測色儀（柯尼卡美能達投資有限公司）；FA-N/JA-N電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；DK-8D數顯恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；U-3900紫外分光光度計（日立高科技公司）；101電熱鼓風干燥箱（泰斯特儀器有限公司）；MN-B榨汁機（濟南松下樂妻電器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

蘋果汁的加工工藝流程：新鮮蘋果→清洗→破碎→榨汁→粗濾→離心分離→蘋果原汁→過濾→抑制酶促褐變→熱裝瓶→密封→殺菌→冷卻→成品。

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 挑選

蘋果當季新鮮采摘，沒有病蟲害，沒有變質，沒有疤痕，果實的大小和成熟度合適，新鮮，果肉飽滿，無黑色斑點。

1.2.2.2 清洗

將挑選好的蘋果用清水洗凈，洗去蘋果表面附著的雜物、灰塵、泥沙和微生物、殘留農藥，祛除果桿。

1.2.2.3 破碎

將洗凈的蘋果去皮后，將蘋果分成合適大小的小塊，以利于配制果汁，提高出汁率。

1.2.2.4 榨汁

蘋果榨汁時要充分，避免浪費。迅速地榨出蘋果汁，使其不與空氣充分接觸。

1.2.2.5 過濾

過濾是在動力或其他外力的作用下，漿料（或含有固體顆粒的熱氣體）中的液體（或氣體）通過介質的操作，使固體顆粒和其他物質被過濾介質保留，與液體（或氣體）分離[8]。如果過濾不充分，則會使蘋果汁中的固體沉淀物過多，而過濾時間過久會使蘋果汁與空氣的接觸時間延長，從而對試驗結果產生不利的影響。所以，在這此試驗中，用八層紗布過濾兩次擠壓的蘋果汁，使蘋果汁從沉淀物中釋放出來。過濾的果汁應該是黃色的不含任何固體沉淀的不透明液體。

1.2.3 蘋果汁抑制酶促褐變處理

1.2.3.1 不同溫度水浴處理對蘋果汁酶活性的影響

大多數多酚氧化酶在60 ℃水浴加熱10 min就會被失活。然而，由于水果組織不耐高溫，加熱溫度和加熱時間過長都會造成蘋果汁中養分的損失，因此需要對水浴的溫度和時間進行嚴格把控。

試驗中，取500 mL的蘋果汁在60，65和70 ℃的水浴溫度下加熱10 min，然后測定0，15，30和60 min的變黑程度。注意：加熱蘋果汁時，應將燒杯口密封，以此來隔離空氣。

1.2.3.2 不同的抗壞血酸濃度添加量對蘋果汁酶活性的影響

抗壞血酸能抑制多酚氧化酶的活性，這是因為抗壞血酸是多酚氧化酶輔基銅離子的螯合劑，它與銅離子鍵相連，從而使多酚氧化酶失活，同時還起到護色作用。在一定的濃度范圍內，抗壞血酸的抑制能力并不顯著。所以從經濟上來看，可以選擇適當的抗壞血酸添加量。

取500 mL蘋果汁中加入濃度分別為0.075%，0.1%，0.3%和0.5%的抗壞血酸，迅速攪拌后密封，以隔絕空氣。分別在0，15，30和60 min后，檢測它們的褐變程度。

1.2.3.3 不同硫代硫酸鈉添加量對蘋果汁酶活性的影響

二氧化硫作為一種高效的抗氧化劑，具有抑制酶促褐變的作用，使用方便，作用顯著，被廣泛應用于飲料和酒類的生產。但是，二氧化硫的濃度要受到嚴格的控制，如果過量的話，可能會引起中毒或者對身體產生不良的后果，還可能會引起消化系統、咽喉、氣管、肝臟、腎臟等產生疾病。一般情況下，添加量在低于0.012 mg/mL以內可以安全食用，0.01 mg/mL左右的SO2足以使酶失活，但由于揮發、反應損耗等原因，通常還會上升到0.012 mg/mL以下。需要指出的是，這類藥劑的加入可能會引起食品的褪色和維生素B1的損傷。

將0.003，0.004，0.005和0.006 g的硫代硫酸鈉添加到500 mL蘋果汁，并迅速攪拌后密封，將其與空氣隔離。分別在0，15，30和60 min后檢測它們的褐變程度。

1.2.4 數據處理

試驗結果均采用平均值±標準差（x±SD）的形式表示，試驗數據以及折線圖均采用Excel 2016軟件進行作圖和數據統計，用SPSS 25.0軟件進行差異分析，所有試驗均重復3次。

1.3 對蘋果汁褐變程度的測定

1.3.1 顏色的測定

褐變是影響果蔬采后貯藏品質和保鮮期最突出的問題之一，對果蔬的外觀品質、商品價值及貯藏時間有極大的影響，進而造成很嚴重的經濟損失[9]。酶促褐變是果汁在加工及貯藏過程中顏色變化的最主要原因，通常會在果汁榨汁過程中出現，果實在破碎時接觸氧氣，同時多酚氧化酶會刺激果汁中的酚類物質羥基化，再將羥基化的物質氧化形成醌，醌類物質發生后續反應產生了棕色色素的過程。因此，利用顏色差異，可以直觀地觀察蘋果汁的顏色變化及酶促褐變的反應。新鮮榨出的蘋果汁一般為乳白色或淺黃色，在接觸到空氣時會產生酶促褐變，并伴隨著果汁顏色褐變。試驗利用CM-5分光光度計對蘋果汁的顏色進行分析，并對其色度進行測量。褐變率反映褐變程度，根據公式（1）計算[10]來表示。

式中：L0為樣品開始時的L值；Lt為樣品在時間t時的L值。

1.3.2 總酚含量的測定

方法：（1）高錳酸鉀滴定法；（2）氨基安替比林比色法；（3）酒石酸比色法；（4）福林酚法。

試驗采用福林酚法測定總酚含量。樣品中總酚含量（mg/mL）按公式（2）計算。

式中：C為沒食子酸質量濃度，mg/L；V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數；M為取樣量，mL。

1.3.2.1 福林試劑的配制

在2 000 mL磨口回流裝置內加入100 g鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O），25 g鉬酸鈉（NaMoO4·2H2O），700 mL水，50 mL 85%的磷酸和100 mL濃鹽酸，于40 ℃（文火）回流10 h，加入150 g硫酸鋰（Li2SO4）和50 mL蒸餾水，混勻取去冷凝器，加入幾滴液體溴，再蒸沸15 min，以驅逐殘溴及除去顏色，溶液應呈黃色。若溶液有綠色，需再加數滴液溴，再蒸沸除去，冷卻后定容至1 000 mL，過濾，濾液置于棕色瓶中。

1.3.2.2 供試品溶液的制備

量取10 mL蘋果汁，置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL 90%乙醇溶液，靜止2 h，然后進行抽濾，用少量的90%乙醇溶液洗滌濾渣，將濾液置于100 mL棕色量瓶中，用90%乙醇溶液后定溶至刻度上。

1.3.2.3 沒食子酸標準溶液的制備

分別吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mL質量濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸溶液置于10 mL容量瓶中，然后加入1.0 mL的福林酚試劑，搖勻。再加入3.0 mL 100 g/L的碳酸鈉溶液，混勻，定容，并在室溫下避光放置2 h。在765 nm的波長下，測定不同濃度下沒食子酸標準溶液的吸光度（3組平行對照），并繪制標準曲線（見圖1）。

圖1 沒食子酸標準曲線

1.3.3 計算多酚氧化酶活性

量取1 mL蘋果汁，加入蒸餾水，轉移到50 mL容量瓶中并攪拌均勻，充分搖勻，吸出10 mL，倒入250 mL三角形燒瓶中。將1 mL pH 6.4的磷酸緩沖液以及5 mL 0.4 mol/L抗壞血酸溶液添加到其中，并將其完全混合。在充分振蕩的同時，添加5 mL 0.2%的鄰苯二酚溶液。為了保持氧的持續流入，溶液必須保持2 min的充分振蕩。在搖動2 min后，添加5 mL 5%的偏磷酸溶液，使反應終止。然后添加1 mL 0.5%的淀粉溶液，用0.01 mol/L碘酸鉀溶液對抗壞血酸殘渣進行滴定，直到藍色不變為止。

同時進行對照滴定。為此，抽取10 mL懸浮液，注入到另一只三角瓶中，加5 mL偏磷酸，再加入1 mL pH 6.4磷酸緩沖液，5 mL 0.4 mol/L抗壞血酸，再加淀粉液，同樣用0.01 mol/L KIO3溶液滴定。樣品中多酚氧化酶活性按公式（3）計算。

式中：A為多酚氧化酶活性（1 g在20 ℃下，1 min內氧化的抗壞血酸分子量）；50為分析材料懸浮液的總體積，mL；N為分析材料的質量，g；10為測定酶活性所需的懸浮液體積，mL；2為反應時間，min；a為用來滴定對照的0.01 mol/L KIO3溶液體積，mL；b為用來樣品滴定的0.01 mol/L KIO3溶液體積，mL；5為0.01 mol/L抗壞血酸溶液每毫升換算為微克分子數抗壞血酸的系數。

2 結果與分析

2.1 不同溫度水浴加熱對蘋果汁色度、褐變率、多酚氧化酶活性、總酚含量的影響

由圖2可知，蘋果汁隨放置時間推移，L值均出現下降趨勢。水浴加熱蘋果汁有效地抑制蘋果汁的酶促褐變[11]。結果表明，用水浴加熱可使蘋果汁發生褐變，但褐變程度較小，汁液從乳白色轉變為淡黃色，氣味沒有顯著改變，對果汁品質無影響。水浴溫度為70 ℃時，蘋果汁的L值最大，表明蘋果汁的酶促褐變抑制作用顯著。但是隨著時間的推移，蘋果汁的顏色會越來越深，對蘋果汁酶促褐變的抑制作用也會越來越弱。顏色變化程度用褐變率來表示，酶促褐變對蘋果汁的色澤影響較大。不難看出隨著溫度的升高，蘋果汁酶促褐變的褐變率降低，但在不同的時間下，蘋果汁的褐變率隨貯藏時間的增加而增加。通常情況下，多酚氧化酶的活性隨著溫度的升高而下降，但是蘋果中的多酚氧化酶具有較高的熱穩定性，高溫時的酶不易失活。經過水浴加熱抑制多酚氧化酶活性后，前期抑制能力較后期強，高溫改變了蘋果汁多酚氧化酶的空間結構，破壞了活性中心，有效地抑制了褐變[12]。但長期貯藏對多酚氧化酶活性的抑制效果并不明顯，其原因可能在于當蘋果汁回溫后，有一定量的多酚氧化酶復活，這與蘋果汁的酶促褐變密切相關?？偡雍渴翘O果汁非常重要的質量參數，它不僅影響果汁的味道和顏色，而且擁有強大的抗氧化能力和抗菌抗炎作用[13]。蘋果呈褐色時，其總酚含量也隨之下降，所以蘋果汁中總酚含量越高，對其酶促褐變的抑制作用越強。因此水浴溫度為70 ℃時，蘋果汁的酶促褐變抑制作用最顯著。

圖2 經不同溫度水浴加熱10 min的蘋果汁L值、褐變率、多酚氧化酶抑制率和總酚含量

2.2 不同抗壞血酸添加量對蘋果汁色度、褐變率、多酚氧化酶活性、總酚含量的影響

由圖3可知，由于抗壞血酸在褐變反應中將醌類物質還原，阻止醌類物質再氧化生成褐色物質，從而抑制褐變。當抗壞血酸濃度過高時，抗壞血酸可能會自身氧化導致非酶褐變[14]。所以，并不是添加的抗壞血酸量越多，對蘋果汁的酶促褐變抑制效果就越好，過度地添加抗壞血酸并不能對蘋果汁的酶促褐變起到抑制作用。隨著抗壞血酸濃度的上升，蘋果汁的總酚含量升高，出現這種趨勢的原因可能是酶促褐變的發生，導致酚類物質被氧化，含量減少，添加了抗壞血酸后，一方面保護酚類物質不被氧化，另一方面將酚類的褐變中間產物醌及其衍生物還原成酚類物質，使得總酚含量升高，抗壞血酸濃度越高，還原性越高，還原的酚就越多[15]。添加0.5%抗壞血酸時，蘋果汁中殘留的總酚含量最高，表明對參與氧化褐變的酚類物質的抑制作用最有效。在折線圖中，添加量為0.5%與添加量0.075%的作用效果差異不顯著，但添加量卻有很大差異。結果表明以0.075%的抗壞血酸添加量為最佳。

綜上所述，添加0.075%與添加0.5%的效果相似，因此最經濟可行的抗壞血酸添加量為0.075%。

2.3 不同硫代硫酸鈉添加量對蘋果汁色度、褐變率、多酚氧化酶活性、總酚含量的影響

由圖4可知，隨著硫代硫酸鈉添加量的增加，其對蘋果汁酶促褐變的抑制作用也會增強，硫代硫酸鈉對蘋果汁褐變初期的影響就較小，隨著時間的推移，其對蘋果汁褐變的抑制作用逐漸減弱，且對色澤的抑制作用逐漸減弱。但硫代硫酸鈉的添加量必須嚴格控制，SO2氣體的含量不能高于0.012 mg/mL，因此硫代硫酸鈉的最佳添加量為0.006 g。

3 結論

通過3種不同的方法抑制蘋果汁的酶促褐變，包括在水浴中加熱鈍化酶活性、加入抗壞血酸和硫代硫酸鈉，測定出蘋果汁的色度、褐變率、多酚氧化酶活性和總酚含量，綜合評價蘋果汁酶促褐變的抑制能力。經試驗結果分析得出：水浴加熱的最適溫度為70 ℃；抗壞血酸最適宜的添加量為0.075%；硫代硫酸鈉最適宜的添加量為0.012 mg/mL。在這些條件下可以較好地抑制酶促褐變的發生?？紤]到成本和使用方便等因素，在常溫下添加濃度為0.075%的抗壞血酸時，其蘋果汁酶促褐變的抑制效果相對最好。此次研究結果可為解決蘋果深加工中出現的酶促褐變現象提供參考，同時應該結合實際條件，根據不同的要求選擇出最適宜的抑制酶促褐變的方法。