硫磺菌醇提物抗氧化活性及其成分分析

楊晶晶，池延添，易永旺，林國峰，曾亮，魏奇

1.寧德師范學院生命科學學院 （寧德 352100）；2.福建省科技廳產學研合作示范基地 （寧德 352100）；3.閩東特色生物資源福建省高校工程研究中心 （寧德352100）

硫磺菌（Laetiporussulphureus）是一種食藥兩用的大型真菌[1]。硫磺菌主要生長在針葉樹和橡樹等闊葉樹的莖上[2]。硫磺菌富含多糖、氨基酸、甾醇類化合物等活性物質，并具有多種藥用功效。已有研究表明硫磺菌能夠抑制肺癌細胞的生長，并且能夠有效抑制病原菌的生長，如小麥赤霉、金黃色葡萄球菌、黑根霉等[3]。硫磺菌所產生的甲酸酯物質對機體代謝調節具有十分重要的作用[4]。

自由基會對機體的細胞和組織造成損傷，進而引起機體的衰老和一系列慢性疾病的發生。已有研究表明阿爾茲海默癥、癌癥、動脈粥樣硬化、糖尿病和衰老等疾病與自由基有關[5]。人工合成的抗氧化劑具有毒副作用，對人體具有不利影響[6]。因此，從植物中開發天然抗氧化劑，能夠有效延長食品的貯藏期。

此研究以硫磺菌為原料，探究硫磺菌醇提物的體外抗氧化活性，同時測定了硫磺菌醇提物的多糖、總酚、黃酮和三萜含量。此研究能夠促進天然食品抗氧化劑的進一步開發。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 原料與試劑

試驗原料：硫磺菌（寧德師范學院生命科學學院生物活性物質研究實驗室）。

水溶性維生素E、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、蘆丁、齊墩果酸、2,2-二氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）銨鹽（ABTS）、沒食子酸（北京索萊寶科技有限公司）；水楊酸、葡萄糖、無水乙醇、硫酸、亞硝酸鈉、氯乙酸、硫酸亞鐵、磷酸鈉緩沖液和鐵氰化鉀等（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.1.2 儀器與設備

DHG-9070A鼓風干燥箱、HWS-24恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；KQ-500DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；N-1300旋轉蒸發儀（日本Tokyo Rikakikai公司）；SHZ-DⅢ 循環水真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；BO-250T高速多功能粉碎機（永康鉑歐五金廠）；SPectra Max i3X多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備

將硫磺菌子實體置于65 ℃烘箱中烘干、粉碎、過篩。稱取100 g硫磺菌粉末，按料液比1∶10 g/mL加入無水乙醇，在85 ℃水浴鍋中提取3 h，去除殘渣，收集濾液。濾液用旋轉蒸儀去除乙醇，經真空干燥后得硫磺菌醇提物。

1.2.2 硫磺菌醇提物對DPPH自由基的清除作用

參照陳曉寧等[7]的方法測定硫磺菌醇提物清除DPPH自由基的能力，以水溶性維生素E為陽性對照。DPPH（8 mg）溶解于無水乙醇中（40 mL），置于超聲清洗器中處理5 min。測定DPPH溶液在波長519 nm處的吸光度，用無水乙醇調至1.2。硫磺菌醇提物的質量濃度為125，250，500，1 000和2 000 mg/mL。將相同體積的DPPH溶液和樣品溶液（100 μL）混勻后，置于暗室反應30 min，測定波長519 nm處的吸光度，記為A1，相同操作條件下獲得A2和A0。DPPH自由基清除率按式（1）計算。

式中：A1為樣品與DPPH反應的吸光度；A2為無水乙醇代替DPPH的吸光度；A0為無水乙醇代替樣品的吸光度。

1.2.3 硫磺菌醇提物對ABTS自由基的清除作用

參照齊睿婷[8]的方法測定硫磺菌醇提物清除ABTS自由基的能力，以水溶性維生素E為陽性對照。將相同體積的過硫酸鉀溶液（2.6 mmol/L，10 mL）和ABTS溶液（7.4 mmol/L，10 mL）混勻后，置于暗室反應12 h。硫磺菌醇提物的質量濃度為62.5，125，250，500和1 000 μg/mL。ABTS溶液在波長734 nm處的吸光度調至0.7。將相同體積的ABTS溶液和樣品溶液（100 μL）混勻后，置于暗室反應6 min，測定波長734 nm處的吸光度，記為A1，相同操作條件下，獲得A2和A0。ABTS自由基清除率按式（2）計算。

式中：A1為樣品與ABTS反應的吸光度；A2為蒸餾水代替ABTS的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.4 硫磺菌醇提物對羥自由基的清除作用

參照顏軍等[9]的方法測定硫磺菌醇提物清除羥自由基的能力，以水溶性維生素E為陽性對照。硫磺菌醇提物的質量濃度為0.5，1，2，4和8 mg/mL。將相同體積的水楊酸-乙醇溶液（9 mmol/L，1 mL）、樣品溶液，FeSO4溶液（9 mmol/L，1 mL）和H2O2溶液（9 mmol/L，1 mL）混勻后，置于37 ℃恒溫培養箱中反應30 min。測定波長510 nm處的吸光度，記為A1，相同操作條件下，獲得A2和A0。羥自由基清除率按式（3）計算。

式中：A1為樣品組的吸光度；A2為蒸餾水代替H2O2的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.5 硫磺菌醇提物對超氧陰離子自由基清除作用

參照譚亮等[10]的方法測定硫磺菌醇提物對超氧陰離子自由基的清除能力，以水溶性維生素E為陽性對照。硫磺菌醇提物的質量濃度為0.5，1.0，2.0，4.0和8.0 mg/mL。將5 mL Tris-HCl（0.05 mol/L，pH 8.2）和5 mL樣品溶液混勻后，于25 ℃水浴中靜置20 min。加入0.4 mL鄰苯三酚溶液（10 mmol/L）混勻后，于25 ℃靜置5 min。再加入0.2 mL鹽酸溶液（12 mol/L）終止反應。測定波長325 nm處的吸光度，記為A1，相同操作條件下，獲得A2和A0。超氧陰離子自由基清除率按式（4）計算。

式中：A1為樣品組的吸光度；A2為蒸餾水代替鄰苯三酚的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.6 硫磺菌醇提物還原能力的測定

參照張晨[11]的方法測定硫磺菌醇提物還原能力，以水溶性維生素E為陽性對照。硫磺菌醇提物的質量濃度為0.31，0.63，1.25，2.50和5.00 mg/mL。于15 mL玻璃試管中分別加入2.5 mL樣品溶液、2.5 mL磷酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）、2.5 mL鐵氰化鉀溶液（10 mg/mL）混合均勻，在50 ℃條件下靜置20 min，再加入2.5 mL三氯乙酸（100 mg/mL），混合均勻，離心（3 500 r/min，10 min）。取2.5 mL的上清液，加入2.5 mL蒸餾水和1 mL氯化鐵溶液（1.0 mg/mL），混合均勻。測定波長700 nm處的吸光度，記為A1，相同操作條件下，獲得A2和A0。還原力按式（5）計算。

式中：A1為樣品組的吸光度；A2為樣品組本底的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.7 硫磺菌醇提物中多糖含量的測定

參照梁琰等[12]的方法測定多糖含量。葡萄糖標準溶液的質量濃度分別為0，100，200，300，400，500，600，700，800和900 μg/mL。在15 mL離心管中分別加入1 mL樣品溶液，1 mL 5%的苯酚溶液和5 mL濃硫酸，混勻，靜置15 min，測定波長490 nm下的吸光度。葡萄糖的標準曲線為Y=0.004X+0.146 8（R2=0.999）。

1.2.8 硫磺菌醇提物中總酚含量的測定

參照陳龍等[13]的方法測定總酚含量。沒食子酸標準溶液的質量濃度分別為0，20，100，150，200，300，400，500和600 μg/mL。在15 mL離心管中分別加入200 μL樣品溶液，800 μL蒸餾水和200 μL福林-酚，混合，避光靜置6 min，再加入2 mL 7% Na2CO3溶液和1.6 mL蒸餾水，混勻后置于暗室反應90 min，測定760 nm波長處的吸光度。沒食子酸標準曲線為Y=0.001 8X+0.040 7（R2=0.992）。

1.2.9 硫磺菌醇提物中總黃酮含量的測定

參照楊文慧等[14]的方法測定總黃酮含量。蘆丁標準溶液的質量濃度分別為0，20，100，150，200，300，400，500和600 μg/mL。在15 mL離心管中加入5 mL樣品溶液和300 μL 的NaNO2溶液（5%），混勻后，避光靜置6 min。加入300 μL的Al(NO3)3溶液（10%），混勻后，避光靜置6 min。加入4.4 mL NaOH溶液（4%），混勻后，避光靜置12 min，測定510 nm波長處的吸光度。蘆丁的標準曲線為Y=0.003 5X-0.015 5（R2=0.997）。

1.2.10 硫磺菌醇提物中總三萜含量的測定

參照亓小妮[15]的方法測定總三萜的含量。齊墩果酸標準溶液的質量濃度分別為0，20，40，60，80和100 μg/mL。取0.5 mL樣品溶液，在90 ℃條件下揮干，冷卻后加入0.25 mL香草醛-醋酸溶液（5%），0.4 mL蒸餾水和1.5 mL高氯酸，于60 ℃水浴15 min，再加入2.5 mL冰醋酸，在540 nm波長處測定樣品的吸光度。齊墩果酸的標準曲線為Y=0.007 2X-0.040 3（R2=0.997）。

1.3 數據分析

采用Excel統計軟件進行數據分析，試驗的重復次數為3次。應用SPSS 20軟件進行顯著性分析，P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 硫磺菌醇提物清除DPPH自由基的測定

如圖1所示，當水溶性維生素E的質量濃度為125 μg/mL時，水溶性維生素E已經能夠將DPPH自由基全部清除。硫磺菌醇提物對DPPH自由基的清除作用隨其質量濃度的增加隨之增強。當硫磺菌醇提物的質量濃度為2 000 μg/mL時，此時硫磺菌醇提物能夠將DPPH自由基全部清除，其清除率為96.26%±0.42%。硫磺菌醇提物的DPPH自由基清除率EC50值為820.20 μg/mL。

圖1 硫磺菌醇提物對DPPH自由基的清除能力

2.2 硫磺菌醇提物清除ABTS自由基的測定

由圖2可知，當質量濃度為62.50 μg/mL時，水溶性維生素E已經能夠將ABTS自由基全部清除。硫磺菌醇提物對ABTS自由基的清除作用呈現上升趨勢。當硫磺菌醇提物的質量濃度為1 000 μg/mL時，硫磺菌醇提物已經能夠將ABTS自由基基本清除，其清除率為94.27%±2.27%。硫磺菌醇提物的ABTS自由基清除率EC50值為317.09 μg/mL。

圖2 硫磺菌醇提物對ABTS自由基的清除能力

2.3 硫磺菌醇提物清除羥自由基的測定

由圖3可知，隨著水溶性維生素E和硫磺菌醇提物質量濃度的增加，其對羥自由基的清除率呈現出逐漸增強的趨勢。當硫磺菌醇提物的質量濃度為8 mg/mL時，此時硫磺菌醇提物對羥自由基的清除率達到最大值（75.88%±4.86%）。在相同質量濃度下，硫磺菌醇提物對羥自由基的清除作用小于水溶性維生素E。硫磺菌醇提物的羥自由基清除率EC50值為3.81 mg/mL。

圖3 硫磺菌醇提物對羥自由基的清除能力

2.4 硫磺菌醇提物清除超氧陰離子自由基的測定

如圖4所示，當質量濃度為0.50～8 mg/mL時，水溶性維生素E和硫磺菌醇提物對超氧陰離子的清除能力呈現逐漸增強的趨勢。當質量濃度為8 mg/mL時，硫磺菌醇提物對超氧陰離子的清除率為50.84%± 4.86%。在相同質量濃度下，硫磺菌醇提物對超氧陰離子自由基的清除率低于水溶性維生素E。硫磺菌醇提物的超氧陰離子自由基清除率EC50值為7.31 mg/mL。

圖4 硫磺菌醇提物對超氧陰離子自由基的清除能力

2.5 硫磺菌醇提物還原能力的測定

如圖5所示，當質量濃度為0.31～5.00 mg/mL時，水溶性維生素E和硫磺菌醇提物的還原力呈現出逐漸增強的趨勢。隨著硫磺菌醇提物的溶液濃度逐漸增加，其還原能力也隨之逐步提升。當質量濃度為5.00 mg/mL時，硫磺菌醇提物的還原力為0.47。在相同質量濃度下，硫磺菌醇提物的還原力小于水溶性維生素E。

圖5 硫磺菌醇提物還原能力

2.6 硫磺菌醇提物活性成分分析

硫磺菌醇提物中的多糖、多酚、黃酮和三萜含量如表1所示。由表1可知，硫磺菌醇提物中含有多糖（117.08±5.46 mg/g）、多酚（21.29±0.25 mg/g）、黃酮（8.28±0.40 mg/g）和三萜（19.29±1.22 mg/g）。硫磺菌醇提物中活性成分的含量依次為多糖＞多酚＞三萜＞黃酮。

表1 硫磺菌醇提物活性物質含量 單位：mg/g

3 結論

硫磺菌具有豐富的食用價值和藥用價值。已有研究表明，硫磺菌具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗氧化和降血脂等作用[16-17]。張鳳麗等[18]研究發現多孔菌科靈芝的醇提物能夠有效清除DPPH、ABTS和羥自由基。胡金霞等[19]研究發現桑黃醇提物對超氧陰離子自由基具有抑制的作用。李巍等[20]研究發現硫磺菌提取物具有抗氧化活性，硫磺菌的不同極性提取物（石油醚、氯仿、甲醇和乙酸乙酯提取物）能夠有效清除自由基ABTS和DPPH自由基。此研究發現硫磺菌醇提物具有清除羥自由基、ABTS自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的活性。該研究結果與李巍等[20]的研究結果相一致。由此可知，硫磺菌具有清除自由基的作用。

此研究采用無水乙醇浸提的方法獲得硫磺菌醇提物，分析了硫磺菌醇提物的活性物質含量。通過測定羥自由基、ABTS自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除能力及結合評估其還原力，從而綜合評價硫磺菌醇提物的抗氧化活性。研究結果表明：硫磺菌醇提物對DPPH、ABTS、羥自由基和超氧陰離子自由基均具有清除作用，且表現出一定的還原能力。硫磺菌醇提物的清除作用的效果依次是ABTS＞DPPH＞羥自由基＞超氧陰離子自由基。硫磺菌醇提物中的多糖含量最高（117.08±5.46 mg/g），黃酮含量最低（8.28±0.40 mg/g）。由此可知，硫磺菌具有開發為天然食品抗氧化劑的潛力，該研究能夠為硫磺菌精深加工提供理論基礎。