基于磁性分子印跡技術檢測食品中利巴韋林含量

金文麗，周鑫魁，李建民，張連鋼，張婧蕾，袁嘉男

1.嘉峪關市食品藥品和醫療器械檢驗檢測中心 （嘉峪關 735100）；2.甘肅省商業科技研究所有限公司 （蘭州730010）

利巴韋林為白色結晶性粉末，無臭。易溶于水[1-2]。被用于治療病毒性引起的肝炎，腮腺炎，肺炎[3]。利巴韋林服用之后會引起神經系統反應，比如眩暈，還會導致消化系統反應，出現惡心、消化不良等癥狀[4]。違法商家會將其添加在殖飼料中，減少養殖過程病毒的侵害[5]。消費者會購買并食用帶有抗生素的肉制品，從而對人體健康產生潛在性的危害。國家標準規定肉及肉制品中不得檢出利巴韋林[6]。利巴韋林的檢測，需要經過酸化提取，硼酸固相萃取柱凈化，液相色譜質譜聯用儀檢測。在實際檢測試驗中，實驗操作要求極高，微小的偏差都會影響利巴韋林的檢測結果[7-8]。所以建立一種準確性高、穩定性好、易操作的檢測方法是有必要的。

分子印跡是通過印跡分子與模板分子之間通過π鍵和非共價鍵結合。生成的印跡聚合物[9-10]。分子印跡微球技術，將聚合物微球經過研磨，得到粒徑均一的分子印跡吸附材料[11]?？捎糜诠滔噍腿∵^程中。本研究旨在利用自主合成磁性分子印跡材料[12]，建立一種穩定性良好的快速，高效，準確，易操作的利巴韋林檢測方法?，F有報到中，很少由關于磁性分子印跡材料用于食品中利巴韋林的檢測的實驗。研究也為利巴韋林檢測方法提供新的思路，為磁性分子印跡拓寬應用領域打好基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

7307振動樣品磁強計（美國Lake Shore公司）；H-800透射電鏡（日本日立公司）；島津20A液相色譜儀（日本島津科技有限公司）；IRSpirit紅外光譜儀（日本島津科技有限公司）。

利巴韋林（化學純，南京都萊生物技術有限公司）；氯化鐵，分析純、氯化亞鐵（分析純，天津市百世化工有限公司）；α-甲基丙烯酸（MAA，分析純，阿拉丁試劑上海有限公司）；三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM，分析純，阿拉丁試劑上海有限公司）；偶氮二）；硅烷偶聯劑KH570（MPS，分析純，阿拉丁試劑上海有限公司）；甲苯（分析純，天津市化學試劑公司）；正硅酸乙酯（TEOS，分析純、天津光復科技發展有限公司）；聚乙烯醇2000（分析純、天津光復科技發展有限公司）；鹽酸（分析純、天津光復科技發展有限公司）；甲醇（色譜純，北京百靈威科技有限公司）；乙腈（色譜純，北京百靈威科技有限公司）；去離子水（用優普超純水制備儀制備）；肉及肉制品樣品（購于超市及農貿市場）。

1.2 方法

1.2.1 Fe3O4磁性化合物制備

參考文獻[13]方法，利用共沉淀法制備磁性Fe3O4。稱取4.7 g氯化鐵和1.9 g氯化亞鐵于300 mL球形，可加熱，耐壓反應釜中。加入120 mL去離子水，通入氮氣20 min，加入10.5 mL氨水，繼續通入20 min氮氣，密封反應釜。將反應釜加熱至內部溫度105 ℃，反應1 h。反應結束，冷卻至常溫，用強磁計在反應釜外部吸附生成的Fe3O4磁性化合物，將上層反應殘留液傾倒出反應釜，并反復加入去離子水洗滌Fe3O4磁性化合物，直至洗滌液變為中性。收集Fe3O4磁性化合物與干燥皿中，于60 ℃真空干燥6 h。得到黑色粉末即為Fe3O4磁性化合物。

1.2.2 含Fe3O4磁性化合物聚合單體制備

參考文獻[14]方法，以TEOS為硅源，堿催化溶膠-凝膠法，制備Fe3O4磁性化合物聚合單體。稱取1.0 g 1.2.1小節中制備的Fe3O4磁性化合物于500 mL磨口三角瓶中，加入200 mL乙醇，超聲使Fe3O4磁性化合物分散于乙醇中?？焖贁嚢璨⒁来慰焖偌尤? mL去離子水、8 mL氨水和9 mL TEOS，迅速蓋緊瓶蓋。于電磁攪拌加熱器上，轉速300 r/min于，70 ℃反應5 h。用強磁計在三角瓶外部吸附生成產物，傾倒出全部上層殘留液體，并反復加入去離子水洗滌產物，直至洗滌液變為中性。向瓶中加入200 mL乙醇，超聲使其分散?？焖贁嚢璨⒓尤?2 mL MPS，在溫度40 ℃、轉速300 r/min條件下攪拌反應8 h，反應產物經外磁場分離，并用去離子水多次洗滌。最后，將產物于60 ℃真空干燥6 h。得到黑色粉末，即為Fe3O4磁性化合物聚合單體。

1.2.3 利巴韋林磁性分子印跡微球（MMIPs）制備

參考文獻[15]方法。在三口反應瓶中加入0.32 g利巴韋林，0.1 g AIBN，0.02 g聚乙烯醇和120 mL去離子水。充入20 min氮氣，攪拌下升溫至65 ℃使其完全溶解。加入0.2 g 1.2.2小節中制備的Fe3O4磁性化合物聚合單體，持續通入氮氣，以1滴/3 s的滴速由加液漏斗滴加0.45 mL MAA和14.0 mL TRIM，10.0 mL苯的混合溶液，滴加結束后，持續通氮氣，攪拌下升溫至70 ℃反應7 h。聚合反應結束后將得到的聚合物微球濾出，依次用蒸餾水、甲醇、丙酮各100 mL洗滌。除去洗掉苯、剩余的有機單體等，按甲醇-乙酸體積比70∶30索氏抽提48 h，洗去分子模板，用去離子水將分子印跡清洗干凈。直至清洗液液用紫外檢測不到模板分子，在50 ℃下真空干燥24 h，放入干燥器備用。磁性非分子印跡微球（MNIPs）的制備與MMIPs相同，但不加入利巴韋林。

1.2.4 利巴韋林液相色譜檢測條件

色譜條件：a）色譜柱4.6×150 mm，C18鍵合填料色譜柱；b）流動相為50 mmol/mL的pH 4.0乙酸銨緩沖液+乙腈；c）流速為1 mL/min；d）柱溫為30 ℃；e）進樣量為20 μL；f）波長為230 nm。

1.2.5 利巴韋林MMIPs和MNIPs吸附容量測定

分別稱取7份0.01 g MMIPs和MNIPs置于10 mL離心管中，7支離心管中分別加入5.00 mL不同質量濃度的利巴韋林乙腈溶液，其質量濃度分別為1，2，5，10，20，30和50 μg/mL。在常溫下渦旋振蕩1 min，用強磁計操作進行利巴韋林MMIPs和MNIPs與溶液分離，并通過液相色譜檢測殘留乙腈溶液中利巴韋林的含量。按式（1）計算MMIPs和MNIPs對利巴韋林的吸附容量。并繪制靜態吸附等溫線。

式中：Q為吸附容量，mg/kg；C初始為吸附前利巴韋林初始質量濃度，μg/mL；C殘留為吸附后利巴韋林殘留質量濃度，μg/mL；V為溶液體積，mL；m為MMIPs和MNIPs的使用質量，g。

分別稱取7份0.01 g MMIPs和MNIPs置于10 mL離心管中，7支離心管中分別加入5.00 mL質量濃度為30 μg/mL的利巴韋林乙腈溶液。在常溫下，分別渦旋振蕩10 s，20 s，30 s，45 s，1 min，2 min和5 min，用強磁計操作進行利巴韋林MMIPs和MNIPs與溶液分離，并通過液相色譜檢測，殘留乙腈溶液中利巴韋林的含量。按式（1）計算MMIPs和MNIPs對利巴韋林的吸附容量。并繪制吸附動力學曲線。

1.2.6 利巴韋林MMIPs專一性驗證

利巴韋林結構為1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酰胺，現將利巴韋林，阿昔洛韋，青霉素，四環素等抗菌或抗病毒藥物混合，配制成溶液。其質量濃度分別為利巴韋林10 μg/mL，阿昔洛韋10 μg/mL，青霉素10 μg/mL，四環素10 μg/mL。分別稱取4份0.01 g MMIPs置于盛有上述溶液的10 mL離心管中，在常溫下，渦旋振蕩1 min，用強磁計操作進行利巴韋林MMIPs與溶液分離，并通過液相色譜檢測殘留溶液中利巴韋林的含量。并參考文獻[18]方法檢測殘留阿昔洛韋的含量，參考文獻[19]方法檢測殘留青霉素的含量，參考文獻[20]方法檢測殘留四環素的含量。

1.2.7 MMIPs對利巴韋林的吸附pH條件

在不同pH環境下，分子印跡對目標物質利巴韋林的吸附性質也有所不同。分別用pH為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0的乙腈緩沖液，配制10 μg/mL的利巴韋林溶液。分別取上述溶液5.00 mL于10 mL離心管中。按照1.2.5小節處理，并進入高效液相色譜儀測定利巴韋林的含量。

1.2.8 利巴韋林溶液中溶劑對吸附效果的影響

目標物被吸附在MMIPs上，可以用甲醇、甲醇-水溶液、純水將其從分子印跡上洗脫下來，所以上樣溶液不能是含純甲醇或者含水的溶液。一定要選擇合理的溶液比例，確保MMIPs對目標物達到最佳吸附條件。選擇體積乙腈體積分數為0，5%，10%，15%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%和100%的乙腈-水溶液，配制10 μg/mL的利巴韋林標準溶液。分別取上述溶液5.00 mL于10 mL離心管中。按1.2.5小節處理，并進入高效液相色譜儀測定殘留液中利巴韋林的含量，用強磁計操作進行利巴韋林MMIPs與溶液分離，用5 mL去離子水洗滌MMIPs，收集全部洗滌液，進入液相色譜檢測。

1.2.9 固相分散萃取填料的制備

稱取30 g MMIPs，45 g PSA，45 g C18和60 g無水硫酸鈉，混合后，于均質機中均質混勻。得到灰黑色固相分散萃取填料。

1.2.10 樣品前處理

肉及肉制品一般為固體。其中含有大量蛋白質、油脂等雜質，會對液相色譜、液相質譜檢測結果造成影響。需要建立一種方法，既能有效地從樣品中提取目標物利巴韋林，又能減少雜質的影響。由于利巴韋林易溶于水、較易溶于甲醇、乙腈，所以可以用乙腈直接提取經分子印跡固相萃取填料凈化富集，用水洗脫，進行檢測。

稱取5.00 g粉碎后的樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈提取，乙腈可以使樣品蛋白質變性沉淀。渦旋2 min后，加入2 g無水硫酸鈉，渦旋振蕩1 min后，在2 000 r/min條件下離心2 min。取全部上清液于新的50 mL離心管中，加入1.0 g固相分散萃取填料，渦旋振蕩1 min，用強磁計操作進行利巴韋林MMIPs于溶液分離。用1 mL乙腈洗滌離心管底部黑色固體粉末，棄去乙腈，用1 mL去離子水洗滌離心管底部黑色固體粉末，收集全部洗滌液，經過0.22 μm濾膜后，進入液相色譜檢測。并驗證實際樣品檢測中的回收率，精密度，檢出限，線性范圍。

2 結果與討論

2.1 表征

2.1.1 MMIPs電鏡表征

由圖1可知，所制備的MMIPs呈球形，微球平均粒徑為2.5 μm。從電鏡圖中可以看出，微球粒徑均勻，且沒有其他不規則形狀。說明制備的材料單分散性良好。材料具有單分散性，有利于后續實驗中目標物的吸附和解析。同樣增加材料的使用穩定性。材料中加入Fe3O4磁性化合物聚合單體，該單體中有SiO2，增加材料剛性。后續實驗中該材料在離心，渦旋，超聲條件下仍保持良好的機械強度，確保吸附性能的穩定。

圖1 MMIPs透射電鏡圖

2.1.2 MMIPs紅外表征

由圖2可知，Fe3O4磁性化合物聚合單體，915 cm-1處為聚合物單體的環氧基伸縮振動吸收峰，1 097 cm-1處出現的譜帶為SiO2的不對稱伸縮振動吸收，1 635 cm-1為C＝C的伸縮振動峰。經聚合反應，得到MMIPs微球，C＝C參與反應，該處吸收峰消失。2 920 cm-1和2 850 cm-1處出現了—CH2—的不對稱伸縮振動峰和對稱伸縮振動峰，說明發生了聚合反應。

圖2 MMIPs紅外光譜圖

2.2 利巴韋林液相色譜圖

由圖3可知，利巴韋林在2.248 min出現特征色譜峰，峰型良好，沒有嚴重的前延和拖尾現象，周圍沒有雜質峰影響定量積分。證明建立的樣品前處理條件能達到凈化目的，色譜條件能達到分離定量及定性的目的。

圖3 利巴韋林標準及樣品色譜圖

2.3 利巴韋林MMIPs和MNIPs吸附容量

以MMIPs和MNIPs對利巴韋林的吸附容量為縱坐標，吸附母液濃度為橫坐標，繪制的靜態吸附等溫線如圖4（a）所示。以MMIPs和MNIPs對利巴韋林的吸附容量為縱坐標，吸附時間為橫坐標，并繪制吸附動力學曲線如圖4（b）所示。

圖4 MMIPs和MNIPs對利巴韋林的吸附等溫線（a）和吸附動力學曲線（b）

由圖4（a）可知，MMIPs的吸附容量隨利巴韋林濃度增加而增大，但是當目標物質量濃度超過10 μg/mL時，吸附容量增大趨勢緩慢，當吸附容量超過5 835 μg/g時，達到最大吸附容量，隨利巴韋林濃度增加，吸附容量幾乎不變。是因為MMIPs在制備過程中形成的有效吸附點位的數量有限，無法無限制的吸附目標物。由圖4（b）可知，當吸附時間的增加，吸附容量也隨之增大，在渦旋振蕩1 min內達到吸附平衡，繼續增加吸附時間，吸附容量幾乎不增大。此處可以看出本研究制備的MMIPs能在極短的時間內完成對目標物的吸附。較文獻[20]中報到的40 min達到吸附平衡，極大的提高了吸附效率。這是因為MMIPs微球，在制備過程中形成的2 μm多孔單分散微球，微球比表面積大，與目標物作用速度快。這也為后續檢測方法的建立奠定基礎。而MNIPs對利巴韋林的幾乎不產生吸附效果。也說明MMIPs的制備是成功的。

2.4 利巴韋林MMIPs專一性

MMIPs對利巴韋林，阿昔洛韋，青霉素，四環素的吸附容量如表1所示。由表1可知，MMIPs對利巴韋林吸附效率大于95%，10 μg/mL質量濃度下吸附容量為4 975 mg/kg。而MMIPs阿昔洛韋、青霉素、四環素的吸附效率不超過2%，吸附容量不超過65 μg/g，可以認為MMIPs專一性良好，對利巴韋林以外的藥物幾乎不產生吸附效果，這是因為試驗中四種藥物雖然都是抗菌抗病毒的藥物，結構也有一定程度上的相似性，但是分子大小和空間結構，仍然存在很大差異，與MMIPs吸附位點不完全匹配，所以其他分子的吸附容量很低。

2.5 MMIPs對利巴韋林的吸附pH條件

以pH為橫坐標，殘留液中利巴韋林濃度為縱坐標，得到不同pH對MMIPs吸附利巴韋林的影響趨勢圖，如圖5所示。

圖5 溶液pH對吸附效果的影響

由圖5可知，當pH＜6或者pH＞8時，分子印跡對利巴韋林的吸附有明顯下降趨勢。而在6≤pH≤8范圍內，分子印跡對利巴韋林的吸附并不受pH影響。所以前處理使用乙腈提取，保持提取液，上樣液均為中性，滿足pH要求。

2.6 利巴韋林溶液中溶劑對吸附效果的影響

以溶液中乙腈含量為橫坐標，殘留液和洗脫液中利巴韋林的含量為縱坐標繪制曲線圖，得到溶劑對MMIPs吸附和洗脫效果的影響趨勢，如圖6所示。

圖6 溶液中乙腈含量對吸附和解析效果的影響

由圖6可知，當水含量越大時，測得利巴韋林最終含量逐漸減小，而殘留液中目標物含量逐漸增加。說明，當溶液中水含量增加時，MMIPs對目標物的吸附能力減弱，目標物仍然留在溶液中，影響最終檢測結果。當溶液為純乙腈時，MMIPs可以有效的吸附5 mL溶液中的目標物。而考慮乙腈提取樣品時可以有效沉淀樣品中大部分蛋白質。所以選擇乙腈為提取液進行試驗。這是因為，利巴韋林溶解性導致，利巴韋林結構中含有一個核糖分子，極易溶于水。水對利巴韋林的溶解性，強于MMIPs對利巴韋林的吸附性。而乙腈對目標物的溶解性弱于MMIPs的吸附性，所以可以利用乙腈提取目標物，用水洗脫目標物。這樣的現象增加了實際樣品檢測方法建立的可行性。

2.7 方法加標回收率及方法穩定性實驗

在陰性樣品中分別加入標準溶液，使得樣品中目標物含量為0.5，2.0和10.0 mg/kg，每個濃度水平，平行三組試驗，按照1.2.10小節方法處理樣品，并進行檢測，結果見表2。

表2 三水平加標回收率及精密度實驗結果

由表2可知，此方法對樣品中利巴韋林檢測的回收率在80.6%～90.2%之間，SRSD為4.38%，滿足檢測要求。該方法能達到回收率高、精密度好的效果，是因為分子印跡材料對目標物吸附能力強，富集效果好，選擇良好的洗脫試劑，可以快速高效地洗脫分子印跡固相萃取中的目標物。

2.8 重復性

取陽性樣品，按照1.3.10小節方法處理，進行檢測。重復8次試驗，以每次色譜峰峰面積的相對標準偏差計算定量重復性，以每次色譜峰出峰時間的相對標準偏差計算定性重復性，結果見表3。

表3 重復性實驗結果

SRSD（定性）=0.22%，SRSD（定量）=2.60%。均小于3%，檢測結果穩定，滿足檢測要求。由于分子印跡對利巴韋林吸附速度快，短時間內可以達到吸附平衡，且吸附效率很高，影響吸附效果的因素較少。在相對穩定的實驗條件下，所以得到的檢測實驗結果相對穩定。而且分子印跡沒有吸附樣品中可能影響利巴韋林色譜行為的雜質，所以在色譜分離和檢測過程中，利巴韋林可以在特定的時間范圍內出現色譜峰。

2.9 檢出限及線性范圍

以30 min內基線的3倍噪聲對應的濃度為儀器最低檢出限，以儀器檢出限按照方法稀釋倍數計算方法檢出限，以3倍檢出限濃度對應的濃度為定量限。以30 min內基線的3倍噪聲對應的濃度為儀器最低檢出限，檢出限為0.05 μg/mL。將儀器檢出限帶入方法中計算該方法的方法檢出限，方法檢出限為0.02 μg/g，定量限為0.05 μg/g，適用于微量檢測。分別配制0.1，0.5，1.0，5.0，20.0和50.0 μg/mL利巴韋林標準溶液，以1.3.4小節的色譜條件進行檢測。得到不同濃度標準溶液對應的色譜峰面積，以濃度為橫坐標，面積為縱坐標，檢測結果在0.1～50.0 μg/mL范圍內呈良好線性，線性回歸方程y=541.33x+12.092；相關性系數R2=0.999 8，滿足檢測要求。

3 結論

在成功制備了單分散性良好的磁性分子印跡微球的基礎上，研究了該材料對利巴韋林的吸附容量，吸附pH條件，吸附溶劑等影響因素。以MMIPs為原料，C18、PSA、硫酸鈉為輔料制備針對肉及肉制品中利巴韋林檢測試驗，樣品處理過程使用的固相分散萃取填料。并建立實際樣品中利巴韋林的檢測方法。驗證該方法的回收率，精密度，定量重復性，定性重復性，檢出限和線性范圍。均符合方法學要求，可以用于實際實驗過程中。該方法操作簡便，回收率高，結果穩定，樣品處理耗時短，消耗有機試劑少，適合批量樣品處理。