超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜法測定化妝品中達克羅寧和新康唑

吳旭，金鵬，劉洋，邢海艷，吳義春，孫儷，蘇晶

（淮安市食品藥品檢驗所，江蘇淮安 223300）

新康唑是一種咪唑類新型廣譜抗生素[1]，具有去屑、殺菌和調節皮膚油脂[2]的作用，在我國暫未列入《已使用化妝品原料名稱目錄》，在歐洲化妝品領域中作為去屑劑使用[3]。達克羅寧是一種處方類局部麻醉藥，起效快、持續久，通過阻斷神經沖動或刺激傳導，抑制觸覺和痛覺，具有止痛、止癢及殺菌的作用[4]。美國藥典第35 版已有收錄，我國藥典2020版還未收錄，在我國臨床已廣泛使用多年，有膠漿劑[5]、乳膏劑[6]、洗劑[7]等種劑型，多用于黏膜表面麻醉[8]及皮膚鎮痛、止癢[9]。一些不法商家在化妝品中非法添加新康唑和達克羅寧，使化妝品具有快速去濕疹、去紅血絲、止癢等使用效果。長期使用添加新康唑和達克羅寧的化妝品，會對人體健康產生影響[10-12]，特別是藥物濫用會給兒童帶來的巨大危害[13-14]。

新康唑和達克羅寧在化妝品中的檢測研究較少，已知檢測方法包括紫外分光光度法[15]、高效液相色譜法[16]等。為了更好地服務化妝品安全監管，規范化妝品中禁限用物質檢測技術要求，確?；瘖y品安全質量，筆者采用超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜技術，建立化妝品中新康唑和達克羅寧非法添加物定性、定量檢測方法，提高化妝品非法添加物檢測效率、減少基質干擾、節約檢測成本，并進行方法的驗證及應用研究。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

三重四極桿質譜儀：AB SCⅠEX APⅠ 4000+型，配有V型Turbo電離源，美國AB SCⅠEX公司。

超高效液相色譜儀：Waters Acquity UPLC HClass型，美國沃特世公司。

電子天平：XS205D 型，感量為0.01 mg,瑞士梅特勒-托利多科技有限公司。

高速低溫離心機：Thermo MULTⅠFUGE X1R型，美國賽默飛世爾科技公司。

超聲波清洗儀：KH7200 型，昆山禾創超聲儀器有限公司。

渦旋混合儀：XW-80A 型，上海馳唐電子有限公司。

超純水機：Milli-QR型，美國密理博公司。

甲醇、乙腈、甲酸：均為色譜純，美國默克公司。

氯化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

飽和氯化鈉溶液：稱取40 g 氯化鈉，置于250 mL燒杯中，加入100 mL水，超聲15 min。

鹽酸達克羅寧：質量分數（按C18H27NO2·HCl計）為99.8%，批號為100423-201102，于105 ℃干燥3 h后使用，中國食品藥品檢定研究院。

新康唑：質量分數為99.8%，批號為1028-RC-0061，上海源葉生物科技有限公司。

化妝品樣品：爽膚水、凝膠、潤膚霜、精華油、潤膚乳5種化妝品，市售。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色 譜 柱：Waters ACQUⅠTY UPLC?BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美國沃特世公司）；柱溫：30 ℃；進樣體積：2 μL；流動相：A相為0.1%(體積分數)甲酸溶液，B 相為甲醇，梯度洗脫程序見表1，流量為0.3 mL/min。

1.2.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESⅠ源）；監測模式：正離子多反應監測模式（MRM）；監測離子對及相關參數設定見表2。

表2 達克羅寧和新康唑質譜分析參數Tab.2 Mass analysis parameters of dyclonine and elubiol

1.3 溶液制備

1.3.1 標準儲備溶液

精密稱取達克羅寧、新康唑標準品各10 mg（精確到0.01 mg），分別置于10 mL棕色容量瓶中，加入乙腈使溶解并定容至標線，搖勻。所得達克羅寧、新康唑標準儲備液的質量濃度均為1 000 mg/L。

1.3.2 混合標準儲備溶液

準確移取達克羅寧、新康唑標準儲備溶液各1.0 mL，置于100 mL 棕色容量瓶中，用乙腈稀釋定容至標線，搖勻，于-18 ℃冰箱中避光保存。該混合標準儲備溶液中兩組分的質量濃度均為10 mg/L。

1.3.3 樣品溶液

稱取化妝品樣品0.2 g（精確至0.1 mg），置于20 mL具塞比色管中，加入飽和氯化鈉溶液2 mL，渦旋振蕩30 s，加入乙腈1 mL，渦旋30 s，再加入乙腈10 mL，渦旋30 s，置冰浴中超聲提取30 min，以4 000 r/min 轉速離心10 min。將乙腈層移入另一20 mL具塞比色管中，殘渣再加入乙腈8 mL，重復提取一次，合并兩次乙腈提取液，并用乙腈定容至標線，取上述提取液用0.22 μm 有機微孔濾膜過濾，濾液作為樣品溶液。

1.3.4 空白基質提取溶液

稱取空白化妝品樣品0.2 g（精確至0.1 mg），置于20 mL具塞比色管中，與樣品溶液制備同法處理，作為空白基質提取液。

1.3.5 基質混合標準中間液

準確量取混合標準儲備溶液1.0 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，用空白基質提取液稀釋至標線，搖勻，制成達克羅寧、新康唑質量濃度均為1 000 μg/L的基質混合標準中間液，應現用現配。

1.3.6 系列基質混合標準工作溶液

移取基質混合標準中間液適量，用空白基質提取溶液稀釋，制得達克羅寧、新康唑質量濃度均分別為1、5、10、20、50、100 μg/L 的系列基質混合標準工作溶液，應現用現配。

1.4 實驗步驟

在1.2儀器工作條件下，將系列基質混合標準工作溶液分別進樣測定，以目標物的質量濃度為橫坐標，對應色譜峰面積為縱坐標，進行線性回歸，建立基質標準曲線。取樣品溶液進樣測定，將對應目標物色譜峰面積代入基質標準曲線，得到目標物的質量濃度，再計算得到樣品中目標物的質量分數。

2 結果與討論

2.1 樣品處理方法討論

2.1.1 提取溶劑的選擇

化妝品基質復雜，達克羅寧和新康唑在甲醇、乙腈中的溶解作用良好。以空白加標樣品為對象，比較了飽和氯化鈉-乙腈、乙腈和甲醇三種提取溶液對兩種目標物的提取效率，結果見表3。

表3 不同提取溶劑提取回收率（n=6）Tab.3 Recovery rates of different solvents extraction (n=6)

由表3數據可知，乙腈或飽和氯化鈉-乙腈提取溶液對兩種目標物的提取回收率均較高，但乙腈提取后的樣品不易完全溶解，有結塊，而添加飽和氯化鈉溶液可避免樣品起泡，有利于樣品破乳溶解，對兩種目標物的提取效率均良好，因此選擇采用飽和氯化鈉-乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 提取方式和提取條件的選擇

以陽性樣品為考察對象，分別在冰浴、室溫（25 ℃）、60 ℃三種提取溫度下超聲提取30 min，以及在冰浴下超聲提取0、10、20、30、40 min，考察不同提取方式的目標物提取率，結果列于表4和表5。

表4 不同超聲提取溫度下目標物測定值（n=6）Tab.4 Test results of different ultrasonic extraction temperatures

表5 不同超聲提取時間的目標物測定值（n=6）Tab.5 Test results of different ultrasound extraction times

由表4可知，隨著提取溫度增加，目標物測定值減小，因此確定采用冰浴提取樣品。由表5可知，冰浴條件下兩種目標物測定值隨提取時間的延長而增大，當提取時間超過30 min后有所減小。綜合考慮提取效率和提取時間，選擇超聲提取時間為30 min。最終選擇冰浴條件下超聲30 min來提取目標物。

2.2 色譜條件

2.2.1 液相色譜柱的選擇

實驗比較了Waters ACQUⅠTY UPLC?BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美國沃特世公司）和Thermo Hepersil Gold C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國賽默飛世爾科技公司）2種不同品牌類型的C18色譜柱對目標化合物峰型及分離效果的影響，結果表明，二者均能夠滿足分析要求，由于Waters ACQUⅠTY UPLC?BEH C18色譜柱出峰時間更快，所以選擇其作為實驗用色譜柱。

2.2.2 流動相的選擇

參考《化妝品安全技術規范》，分別采用甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-水和乙腈-0.1%甲酸水體系作流動相，比較了目標化合物的色譜峰形及分離效果，結果表明，在三種流動相體系下目標化合物均可得到有效分離，且色譜峰形良好?？紤]到加入適量酸可以提供質譜的離子化效果，使用甲醇可節約成本，最終選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

2.3 質譜條件

設定色譜流動相流量為0.3 mL/min，按照儀器廠家推薦設置氣流、源溫、毛細管電壓等參數（噴霧壓力：207 kPa；干燥氣壓力：379 kPa；干燥氣溫度：500 ℃；毛細管電壓：5 500 V），利用三重四極桿質譜定量和定性分析，針對每個目標物分別進樣進行質譜參數的優化，主要包括定性和定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量的選擇。從一級質譜掃描圖和二級碎裂質譜掃描圖可知，達克羅寧在ESⅠ正離子模式下，形成[M+H]準分子離子峰290.1，主要碎片離子質荷比為97.8、70.1；新康唑準分子離子峰質荷比為561.3，主要碎片離子質荷比為515.2、489.2。采用儀器優化程序對上述離子對的錐孔電壓和碰撞能量值進行優化，最終確定達克羅寧錐孔電壓分別為102、70 V，碰撞能量分別為16、60 eV，新康唑錐孔電壓分別為115、115 V，碰撞能量分別為45、42 eV。

2.4 專屬性

經過處理的空白化妝品樣品、空白化妝品樣品加標對照品，在選定的色譜條件下注入液相色譜-質譜聯用儀進行分析，色譜圖見圖1。

圖1 空白樣品和空白加標樣品的UHPLC-MS/MS色譜圖Fig.1 UHPLC-MS/MS chromatograms of blank sample and blank spiked sample

由圖1可見，化妝品基質對2種待測物質測定無干擾，說明所建方法適用于化妝品中兩種目標物的測定。

2.5 基質效應

分別選擇爽膚水、凝膠、潤膚霜、精華油、潤膚乳5種典型的空白化妝品作為基質，考察基質效應，結果見表6。由表6數據可以看出，達克羅寧和新康唑在化妝品中存在基質效應，低含量時基質效應影響較小，而高含量時基質效應顯著，所以采用基質標準曲線作為定量校準曲線。

表6 空白化妝品樣品中兩種目標物基質效應Tab.6 Measurement results of matrix effects of two compounds to be tested in blank samples

2.6 標準工作曲線

在設定的分析條件下，測定系列濃度的目標物標準工作溶液和空白樣品的目標物基質標準工作溶液，以目標物質量濃度（ρ）為橫坐標，目標物色譜峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸(權重因子1/X)，并繪制標準曲線、校準曲線，線性方程、相關系數、線性范圍分別見表7 和表8。比較發現校準曲線線性明顯優于標準曲線，故確定用校準曲線進行定量。

表7 標準曲線的線性方程、相關系數及線性范圍Tab.7 Regression equation, correlation coefficient, and linear range of solution standard curve

表8 校準曲線的線性方程、相關系數及線性范圍Tab.8 Regression equation, correlation coefficient, and linear range of blank matrix standard curve

2.7 檢出限和定量限

以測定最低濃度點信噪比大于10 來確定方法定量限。結果顯示，達克羅寧和新康唑溶液濃度為1 ng/mL 時，信噪比分別為1 406.1±5.02，364.1±8.28（n=6），空白樣品加標0.1 μg/g 時，信噪比分別為3 313.0±11.25，277.3±8.77（n=6），均大于10?？紤]不同儀器、不同色譜柱等因素，該方法中達克羅寧和新康唑的定量限均確定為1 ng/mL，當取樣量為0.2 g時，可檢測到的樣品最低質量分數均確定為0.1 μg/g；按照3倍檢出限為定量限原則，以上述定量限計算，確定該方法中達克羅寧和新康唑的檢出限均為0.3 ng/mL，當取樣量為0.2 g 時，可檢測到的樣品最低質量分數均確定為0.03 μg/g。

2.8 精密度和準確度

選擇爽膚水、凝膠、潤膚霜、精華油、潤膚乳5種典型的空白化妝品樣品作為驗證基質，在方法定量限、兩倍方法定量限和十倍方法定量限進行三水平空白基質加標試驗，每個水平重復6次，進行重復性試驗，結果見表9。

表9 5種典型基質中兩種目標物的精密度和準確度Tab.9 Precision and accuracy assessment for two target substances in 5 typical matrices

根據化妝品補充檢驗方法管理辦法，被測組分含量在0.01～0.1、0.1～1、1～10 mg/kg時，相對標準偏差分別為小于等于21%、小于等于15%、小于等于7.5%。被測組分添加水平小于等于0.1、0.1～1、1～100 mg/kg 時回收率范圍分別為60%～120%、80%～110%、90%～110%。由表9 數據可知，該方法兩種目標物的精密度和準確度均滿足分析技術要求。

3 結語

通過對化妝品中兩種目標物樣品前處理方法的選擇，分析條件的優化，最終建立了化妝品中達克羅寧和新康唑兩種目標物的液相色譜-串聯質譜檢測方法。該方法分析速度快、靈敏度高、應用范圍廣，可以滿足化妝品中達克羅寧和新康唑兩種目標物的檢測要求，為化妝品中非法添加的檢測提供技術支持。