外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆種子萌發和幼苗抗氧化酶活性的影響

王志科, 關偉龍, 李志偉, 孫于卜

(隴東學院生命科學與技術學院/甘肅省隴東生物資源保護利用與生態修復重點實驗室,甘肅 慶陽 745000)

中國鹽堿地總面積達9.913×107hm2,主要分布在西北、華北、東北、濱海新區及長江中上游[1]。鹽堿化導致植物體代謝受到影響,同時促進毒害物質積累、葉綠體分解、植物光合作用能力下降、有關酶活性降低致使有機物合成速率降低,從而影響植物體的正常發育,造成植株生長纖弱、滯育,阻礙了農業生產的發展[2]。研究結果表明,高鹽濃度的土壤會抑制植物種子的萌發[3],因此如何預防土壤鹽堿化、科學治理鹽堿地以及對已被鹽堿侵蝕的土壤進行修復,成為當前國內外研究熱點。

利用外源物質刺激植物體產生抗逆性反應來提高植物抵抗外界脅迫是有效路徑之一。過氧化氫( Hydrogen peroxide,H2O2)是細胞有氧代謝的產物,也是植物體細胞內應答逆境脅迫的信號分子,廣泛參與植物體的抗性反應[4],且對植物體生理作用有雙重性(迫害和保護),即低濃度H2O2則會提高植物的抗逆性,而高濃度H2O2會對植物體的生長發育起著抑制作用,甚至會導致植物體的死亡[5]。已有大量研究結果證明H2O2能促進種子萌發:外源H2O2浸種可以明顯提高小白菜種子耐鹽性[6];過氧化氫浸種預處理通過降低ABA含量和提高GA含量來提高棉花種子萌發的耐鹽性[7];外源H2O2浸種能增強皂角種子的萌發率[8];過氧化氫浸種預處理可以明顯緩解低溫對花生種子的傷害[9]。

豌豆(PisumsativumL.)是一年生或越年生草本植物[10],也是世界上第四大食用豆類作物。中國是蔬菜豌豆主要生產國[11],種植范圍遍布全國多個省份,且豌豆是深受人們喜愛的豆類食品之一。在食品功效方面,研究發現豌豆具有抗氧化、降血壓、免疫調節等作用[12]。近年,土壤安全問題越來越受到關注,其中土壤鹽堿化成為全球熱點問題。隨著土壤鹽堿化程度的增加,豌豆種子萌發和幼苗生長受到抑制,從而導致其產量和品質大幅度下降[13]。因而通過外源物質提高豌豆種子萌發對鹽的耐受性[14],緩解鹽脅迫對豌豆種子萌發的毒害作用變得非常重要。目前有關外源H2O2在豌豆抗鹽方面的研究報道很少。因此,本試驗研究外源H2O2對豌豆種子萌發和幼苗生長鹽脅迫的緩解機制,確定適宜的外源H2O2濃度,旨在為農業生產中使用外源物質提高作物抗鹽堿能力提供實踐指導和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用豌豆種子,由甘肅省隴東生物資源保護利用與生態修復重點實驗室提供。氯化鈉和30%過氧化氫等藥品均為分析純。

1.2 試驗設計與方法

1.2.1 NaCl濃度的篩選 NaCl溶液濃度設定參考達海蘭[15]的方法,模擬鹽脅迫。選擇大小均一品質良好的豌豆種子,用10 ml含量0.5%的NaClO溶液消毒15 min,然后用自來水沖洗3次,用濾紙吸干種子表面的水分,將種子播于鋪有雙層濾紙的培養皿中,每只培養皿播50粒種子。分別取10 ml不同濃度(17 mmol/L、34 mmol/L、68 mmol/L、85 mmol/L、102 mmol/L、136 mmol/L、170 mmol/L)的NaCl 溶液加入培養皿中,以蒸餾水為對照,共8個處理,每個處理重復3次,操作重復3次。將所有處理放于(25±1) ℃恒溫培養箱中培養。每日觀察和統計發芽數,補充相應的溶液,7 d后對其相關指數進行計算。

1.2.2 外源H2O2浸種處理 由不同濃度NaCl溶液對豌豆種子的處理結果可知,170mmol/L濃度NaCl溶液脅迫效果最佳。選擇大小均一、品質良好的豌豆種子,用10 ml含量0.5%的NaClO溶液消毒15 min,然后用自來水沖洗3次,用濾紙吸干種子表面的水分,分別用170 mmol/L濃度NaCl溶液及5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、80 mmol/L濃度H2O2溶液將豌豆種子浸種8 h,同時以蒸餾水浸種為對照浸種相同時間。之后用蒸餾水沖洗3次,用慮紙吸干種子表面殘留的水分,將種子分別放入鋪有雙層濾紙的培養皿中,每只培養皿放50粒種子,分別加入等量170 mmol/L濃度NaCl溶液。以蒸餾水為對照,共7個處理組,每組至少重復3次,操作重復3次。處理分別為CK:蒸餾水;CG:170 mmol/L NaCl溶液;T1:5 mmol/L H2O2溶液+170 mmol/L NaCl溶液;T2:10 mmol/L H2O2溶液+170 mmol/L NaCl溶液;T3:20 mmol/L H2O2溶液+170 mmol/L NaCl溶液;T4:40 mmol/L H2O2溶液+170 mmol/L NaCl溶液;T5:80 mmol/L H2O2溶液+170 mmol/L NaCl溶液。

將所有處理放于(25±1)℃恒溫培養箱培養。每日觀察并統計發芽數,補充相應的溶液,7 d后對其相關指數進行計算。此外,7 d后取豌豆根和芽用于相關生理指標測定。

1.3 相關指數測定及方法

1.3.1 種子萌發期指標的測定 以根長大于2 mm作為豌豆種子發芽標準,種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數、抗鹽性指數和根相對鹽迫害率計算參考李志萍等[16]的方法。

發芽率=(N7/N)×100%

式中,N7為第7 d的發芽個數,N為所供試豌豆種子數。

發芽勢=(N3/N)×100%

式中,N3為第3 d發芽個數,N為所供試豌豆種子數。

發芽指數(Gi)=∑Gt/Dt

式中,Gt為在時間t日的發芽數,Dt為發芽天數。

活力指數=S×Gi

式中,S為幼苗平均根長,Gi為發芽指數。

抗鹽性指數=(S×Gi)*/(S×Gi)×100%

式中,(S×Gi)*為CG、T1～T5處理活力指數,(S×Gi)為CK活力指數。

相對鹽迫害率=(L-L*)/L×100%

式中,L*為CG、T1～T5處理根長,L為CK根長。

1.3.2 各項生理指標的測定 種子的發芽試驗結束后,每組隨機挑取15株豌豆苗,用直尺和棉線測定幼苗的芽長和根長,計算平均長度(cm);用千分之一天平稱量芽鮮質量和根鮮質量,計算平均值(g)。

1.3.3 脯氨酸、可溶性糖和丙二醛含量的測定 脯氨酸、可溶性糖和丙二醛含量的測定參照李志萍等[16]的方法。

1.3.4 抗氧化酶活性的測定 待測液的提取:用稱量紙稱取0.1 g待測品,放入研缽中,加入預冷的適量50 mmol/L磷酸緩沖溶液(含有5.0 mmol/L DTT、0.1mmol/L EDTA、1% PVP,pH=7.0)研磨充分,迅速轉移到離心管中,10 000g離心15 min。去除離心管中沉淀即為所需酶液。

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫(CAT)測定參照李志萍等[16]的方法。

1.4 數據處理

利用Microsoft Excel 2016 進行數據處理,利用 SPSS 26.0進行單因素方差分析,利用Duncan’s法進行多重比較及差異顯著性分析(α=0.05)。表中數據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 不同濃度NaCl溶液對豌豆種子萌發的影響

由表1可知,與CK相比,17 mmol/L、34 mmol/L、68 mmol/L、85 mmol/L、102 mmol/L、136 mmol/L、170 mmol/L濃度NaCl溶液處理豌豆種子的發芽率分別降低14.74%、18.59%、21.72%、24.05%、24.81%、27.79%及48.82%;發芽勢分別降低了14.14%、21.69%、50.03%、53.67%、56.99%、64.60%及75.52%; 根長分別降低了5.35%、11.29%、11.68%、14.06%、16.63%、29.90%及47.13%;發芽指數分別降低了15.80%、17.32%、20.34%、21.94%、26.23%、39.08%及56.41%;活力指數分別降低了20.30%、26.66%、29.65%、31.99%、38.51%、57.30%及76.95%。與CK相比,170 mmol/L濃度NaCl溶液處理顯著抑制了豌豆種子的發芽率、發芽勢、根長、發芽指數及活力指數(P<0.05),其對發芽率、根長、發芽指數的抑制程度為50.0%左右,因此選擇170 mmol/L濃度NaCl溶液作為豌豆鹽脅迫的最佳濃度。

表1 不同濃度NaCl溶液對豌豆種子萌發的影響

2.2 外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆種子萌發的影響

由表2可知,與CK相比,CG處理顯著抑制了豌豆種子的發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數(P<0.05), 發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數分別降低了48.84%、75.48%、56.41%、76.95%。與CG處理相比,T1～T4處理豌豆種子的發芽率和發芽勢顯著提高(P<0.05)。與CG處理相比,T1處理豌豆種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數分別提高了105.13%、833.70%、201.38%和683.32%。隨著H2O2濃度的增大,T1～T5處理豌豆種子的萌發各項指標呈現先升高后降低的趨勢。結果表明,外源5 mmol/L H2O2處理(T1)能有效緩解鹽對豌豆種子萌發的抑制,并存在濃度效應,表現為在鹽脅迫下,低濃度H2O2促進豌豆種子萌發。

表2 外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆種子發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數的影響

2.3 外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆幼苗生長的影響

由表3可知,與CK相比,CG處理豌豆幼苗的根長和芽長顯著降低(P<0.05),根長和芽長分別降低了47.13%、34.18%。隨著H2O2濃度的增加,T1～T5處理豌豆幼苗的根長呈現先增加后降低的趨勢。其中T1處理緩解豌豆鹽脅迫效果最佳,與CG處理相比,T1處理豌豆幼苗根長顯著增加159.93%(P<0.05)。T1～T5處理豌豆幼苗的芽長呈現先增加后降低的趨勢。其中T1處理緩解豌豆鹽脅迫效果最好,與CG處理相比, T1處理豌豆幼苗芽長顯著增加150.00%。

表3 外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆幼苗根長、芽長、根鮮質量及芽鮮質量的影響

由表3可知,與CK相比,CG處理豌豆幼苗的根鮮質量和芽鮮質量顯著降低(P<0.05),且根、芽鮮質量分別降低了22.68%、12.97%。隨著H2O2濃度的增加,T1～T5處理豌豆幼苗的根鮮質量呈現先增加后降低的趨勢。其中T1處理緩解鹽脅迫的效果最好,與CG處理相比,T1處理豌豆幼苗的根鮮質量顯著增加87.52%(P<0.05)。而T5處理豌豆幼苗的根鮮質量低于CG處理。T1～T5處理豌豆幼苗的芽鮮質量呈現先增加后降低的趨勢。與CG處理相比,T1、T2、T3處理豌豆幼苗的芽鮮質量分別顯著增加了109.67%、97.75%、93.65% (P<0.05)。其中T1處理豌豆幼苗的芽鮮質量最高,而T5處理豌豆幼苗的芽鮮質量低于CG處理。表明外源H2O2緩解鹽脅迫存在濃度效應,表現為低濃度H2O2促進豌豆幼苗生長。

2.4 外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆種子萌發抗鹽性指數和相對鹽迫害率的影響

抗鹽性指數是指種子萌發對不同濃度NaCl溶液的耐受能力。種子萌發后幼苗根長受鹽脅迫的程度,稱為根長相對鹽迫害率。從表4可看出,CG處理豌豆種子萌發的抗鹽性指數為CK的23.05% (P<0.05)。隨著H2O2濃度的增加,T1～T5處理豌豆種子萌發抗鹽性指數不斷降低(P<0.05),且T1～T3處理豌豆種子萌發抗鹽性指數高于CG處理,其中T1處理豌豆種子萌發抗鹽性指數最高,比CG處理顯著提高了683.30%(P<0.05)。T5處理抗鹽性指數最小,為17.90%。隨著H2O2濃度的增加,T1～T5處理相對鹽迫害率呈上升趨勢,其中T3～T5處理相對鹽迫害率高于CG處理,T1處理相對鹽迫害率最低,為-37.43%,表明低濃度外源過氧化氫不僅能緩解鹽脅迫對豌豆根造成的損傷,還能促進根的生長,這與表3的結果相一致。

表4 外源H2O2處理對NaCl脅迫下豌豆種子萌發抗鹽性指數和相對鹽迫害率的影響

2.5 外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆幼苗滲透調節物質和丙二醛含量的影響

脯氨酸和可溶性糖是重要的滲透調節物質,其含量的高低直接影響植物體的抗逆性[9]。由表5可知,T1～T4處理豌豆幼苗根和芽中脯氨酸和可溶性糖含量均高于CG處理,其中T1處理豌豆幼苗根和芽中脯氨酸含量和可溶性糖含量最高。相較于CG處理,T1處理豌豆幼苗根和芽中脯氨酸含量分別提高了40.00%、70.27%,可溶性糖含量分別提高了21.03%、11.53%。

丙二醛是膜脂過氧化的主要產物,其含量的高低可反映植物過氧化損傷的程度。由表5可知,與CK相比,CG處理的豌豆幼苗根和芽中丙二醛含量顯著升高(P<0.05),T1處理豌豆幼苗的根和芽中丙二醛含量顯著低于CG處理,說明低濃度H2O2處理可明顯緩解NaCl脅迫對豌豆組織的損傷,隨著H2O2濃度的不斷升高,作用緩慢削弱。各個處理相比較,T1處理根和芽中丙二醛含量最低。

表5 外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆幼苗根和芽中脯氨酸、可溶性糖及丙二醛含量的影響

2.6 外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆幼苗抗氧化酶活性的影響

由表6可知,與CK相比,CG處理顯著抑制了豌豆幼苗芽中CAT活性(P<0.05),T1處理豌豆幼苗根和芽中CAT的活性最高。與CG相比,T1、T2處理豌豆幼苗根和芽中CAT的活性顯著提高(P<0.05)。但高濃度的H2O2處理CAT活性降低。

由表6可知,與CK相比,CG處理豌豆幼苗根和芽中的SOD、POD活性均顯著提高(P<0.05)。T1處理豌豆幼苗根和芽中的SOD、POD活性最高,與CG處理相比分別提高了45.53%、28.07%,21.06%、28.48%(P<0.05)。隨著H2O2濃度的升高,豌豆幼苗根和芽中的SOD、POD活性均先升高后降低,但都高于CK。

表6 外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆根和芽中CAT、SOD和POD活性的影響

3 討 論

土壤鹽漬化是全球農業生產過程中影響作物產量的因素之一,會導致植物體對養分的難以吸收、土壤板結造成植物體無法生長發育[17]。鹽脅迫會直接影響種子的發芽和幼苗生長,進而會影響其后期的產量[18]。本研究結果表明,不同濃度NaCl溶液處理,豌豆種子的萌發均受到抑制。170 mmol/L濃度NaCl溶液處理顯著抑制了豌豆種子的發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數和幼苗的生長。這與NaCl處理對甜高粱[18]、小白菜[19]和油菜[20]種子萌發的影響一致。

H2O2是一種重要的抗逆信號分子[21],參與種子萌發、各種脅迫響應、植物生長發育和細胞程序性死亡等生理過程[22]。本研究結果表明,5 mmol/L濃度H2O2能夠顯著緩解NaCl脅迫對豌豆種子的萌發和幼苗生長的抑制,并存在濃度效應,表現為低濃度促進。這與外源H2O2浸種能緩解NaCl脅迫對燕麥[23]、小白菜[19]和小麥[24]幼苗生長的抑制結果相一致。

非生物脅迫使活性氧的產生和清除機制失衡,造成自由基產生過多,膜脂氧化嚴重,最終對植物種子的萌發和幼苗生長造成傷害[25]。本研究發現,與CK相比,170 mmol/L濃度NaCl溶液處理(CG)顯著抑制了豌豆幼苗中CAT的活性,提高了SOD和POD活性,這表明豌豆幼苗啟動抗氧化酶系統來抵抗更多活性氧的產生。H2O2可以激活非生物脅迫下,植物細胞內抗氧化酶系統來抵抗更多活性氧對機體造成的傷害[21]。已有研究結果表明,在鹽脅迫下,外源H2O2提高了苦菜幼苗中SOD、POD、CAT和APX酶的活性及可溶性蛋白質、可溶性糖和脯氨酸含量,降低了細胞內H2O2和丙二醛含量[26]。外源H2O2增強了鹽脅迫下小白菜幼苗中SOD、CAT和APX的活性,降低丙二醛含量,以此來抵抗鹽脅迫帶來的氧化損傷[19]。本研究結果與前人的研究結果一致,表明H2O2是參與豌豆抗氧化酶系統的重要信號分子。

植物在遭受非生物脅迫時,會發生滲透脅迫[27]。脯氨酸[28-32]和可溶性糖[33-35]是重要的細胞滲透調節物質,參與多種非生物脅迫[36]。已有研究結果表明,在遭受堿脅迫后,水稻通過可溶性糖含量的變化,調節脯氨酸含量,來提高自身的抗逆性[37]。鹽脅迫下,桑樹葉片中的脯氨酸大量積累[38]。低溫下,塔胞藻胞內的脯氨酸和可溶性糖含量增加[39]。NADPH氧化酶介導的H2O2通過調節脯氨酸的生物合成和降解來減輕鹽脅迫誘導的氧化損傷[40]。由NADPH氧化酶產生的過氧化氫增加了擬南芥在鹽或甘露醇脅迫過程中脯氨酸的積累[41]。本研究發現,與CG相比,外源5 mmol/L H2O2浸種能提高鹽脅迫下豌豆幼苗中脯氨酸和可溶性糖含量,增強了細胞的滲透調節能力,提高了豌豆幼苗的抗鹽能力。

4 結 論

綜上所述,與CG相比,外源5 mmol/L H2O2能夠顯著提高豌豆幼苗中SOD、CAT和POD的活性,降低丙二醛含量,促進滲透調節物質的積累,減輕鹽脅迫造成的氧化損傷,因此顯著提高了豌豆種子萌發的耐鹽性,促進其幼苗生長。