麻風樹JcHDZ28基因克隆與功能分析

唐躍輝, 趙雨凡, 蔣心言, 張英穎, 王 寒, 包欣欣, 范雨杰, 李 彤

(周口師范學院生命科學與農學學院,河南 周口 466001)

非生物脅迫如干旱、高溫、低溫、氧化脅迫、高鹽等都會降低作物產量,給農業生產造成重大的經濟損失。為了適應這些極端環境條件,植物在生理、代謝、形態和分子水平上進化出復雜的調控機制,通過激活或者抑制脅迫相關基因的表達使得植物在這些極端條件下能夠更好地生存[1]。研究結果表明,一些轉錄因子如MYB、NAC、HD-Zip、AP2/ERF、WRKY、bZIP等家族成員參與調控植物生長發育和逆境脅迫的調控[1-6]。

HD-Zip蛋白是植物特異性轉錄因子,具有1個由61個氨基酸組成的高度保守的同源結構域(HD),以及1個與HD的羧基端緊密相連的亮氨酸拉鏈(LZ)元件。HD負責特異性DNA序列結合,調控下游基因的轉錄。LZ元件協助HD-Zip蛋白特異性識別目標DNA序列,起到二聚化的作用[1,7]。植物HD-Zip轉錄因子最先在玉米中被發現,編碼1個涉及葉片發育的HD-Zip I類的轉錄因子[7]。之后,HD-Zip基因在不同的植物中被發現,并通過構建這類基因的功能缺失突變體或功能獲得突變體對其功能進行了研究,結果表明HD-Zip蛋白在植物生長發育和逆境脅迫的調控中扮演重要的角色[6-8]。例如,TaHDZipl-2正調控小麥花期和穗的發育[9];oshox33突變體通過改變GS1和GS2的表達呈現出葉片衰老的表型[10];AtHB12是一種潛在的關鍵調節因子,參與植物葉片發育的調節[11]。除此之外,許多研究結果表明HD-Zip蛋白也參與調節植物對非生物脅迫的響應[12-13]。提高TaHDZipI-5基因的表達水平增強了轉基因小麥對干旱脅迫和冷脅迫的抗性[12];提高OsHOX24基因的表達水平增強了轉基因水稻抗旱、抗鹽能力[13];玉米HD-Zip家族基因Zmhdz10通過調控干旱脅迫相關基因的表達正調控轉基因擬南芥對干旱脅迫的響應[14]。盡管許多物種HD-Zip基因家族成員已被克隆并進行功能分析,然而,麻風樹中參與生長發育和脅迫調控的HD-Zip基因仍然有待挖掘和進一步研究。

麻風樹又名小桐子,由于其具有生長快、適應性強、耐貧瘠、耐干旱、耐鹽堿、種仁含油量高等特點成為生產生物柴油的明星物種,越來越引起科學家的重視[15]。因此,本研究擬從麻風樹中挖掘響應鹽脅迫的HD-Zip家族基因并對其調控的分子機制進行研究,以期為麻風樹耐鹽品種的培育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料與脅迫處理

試驗材料為麻風樹自交系品種GZQX0401和擬南芥Columbia-0。選取6葉期麻風樹的根、莖、葉、花和授粉后35 d的種子進行JcHDZ28基因組織特異性表達分析。鹽脅迫試驗,對6葉期麻風樹直接澆灌150 mmol/L的NaCl溶液,選取脅迫處理0 h、2 h、6 h、12 h和24 h的第4片葉,-80 ℃保存備用。

1.2 JcHDZ28基因序列分析

麻風樹JcHDZ28序列和該基因在別的物種中的同源基因均來自于NCBI(美國國立生物技術信息中心),JcHDZ28在擬南芥中的同源基因來自TAIR數據庫。采用DNA MAN 9.0軟件進行蛋白質氨基酸序列分析。

1.3 JcHDZ28基因亞細胞定位

以麻風樹葉片cDNA為模版,通過RT-PCR技術克隆獲得不含終止密碼子的JcHDZ28編碼序列,隨后將其連接到pBWA(V)HS-GLosgfp載體構建pBWA(V)HS-JcHDZ28-GLosgfp融合表達載體。將構建好的pBWA(V)HS-JcHDZ28-GLosgfp載體和pBWA(V)HS-GLosgfp載體通過聚乙二醇(PEG)介導轉入擬南芥原生質體細胞,在共聚焦掃描顯微鏡(Leica TCS SP8)上獲得定位樣品的熒光圖像。聚乙二醇介導的轉化和原生質體制備參照文獻[16]的方法進行。

1.4 基因克隆與轉基因植株構建

以麻風樹葉片cDNA為模版,通過RT-PCR技術克隆獲得JcHDZ28基因的全長編碼序列,測序后,將測序正確的序列連接到p1301載體KpnI和XbaI的酶切位點之間,構建35S::JcHDZ28-p1301植物表達載體。然后通過GV3101介導的花序浸染法將35S::JcHDZ28-p1301載體轉化到擬南芥中獲得轉基因植株[14]。通過潮霉素、β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色和RT-PCR確定有效JcHDZ28轉基因植株用于后續試驗研究,以期為麻風樹耐鹽品種的培育提供理論依據。

1.5 轉JcHDZ28基因植株鹽脅迫分析

首先用潮霉素將野生型擬南芥和轉JcHDZ28基因植株種子消毒,4 ℃暗處理2 d后,將擬南芥Columbia-0(WT,野生型)和轉JcHDZ28基因植株種子點播到1/2 MS和含有100 mmol/L NaCl的1/2 MS培養基中,置于22 ℃生長間中生長(16 h 光照/8 h黑暗),20 d后觀察表型。

1.6 生理指標分析

選用鹽脅迫處理15 d的野生型擬南芥和轉JcHDZ28基因植株葉片進行相對電導率和脯氨酸含量測定。相對電導率的測定方法參照文獻[14],脯氨酸含量測定方法參照文獻[17]。

1.7 RNA提取和定量PCR分析

RNA采用TRIzol試劑進行提取,采用Invitrogen SuperScript III逆轉錄酶試劑盒合成第一鏈cDNA,具體操作方法參照試劑盒使用說明書進行。采用SYBR PremixExTaqTMII 試劑盒和LightCycler 480定量PCR儀進行qRT-PCR檢測?；蛳鄬Ρ磉_量采用2-△△Ct方法進行計算。本研究所用引物信息見表1。

表1 本研究所用引物

2 結果與分析

2.1 JcHDZ28基因的生物信息學分析

設計特異性引物,以麻風樹葉cDNA為模版,通過RT-PCR克隆獲得JcHDZ28基因編碼區序列,測序并通過NCBI比對,結果表明,JcHDZ28基因編碼區序列(CDS)全長882 bp,編碼293個氨基酸。我們進一步通過DNA MAN軟件對JcHDZ28及其與在別的物種中的同源基因的相似性進行了分析,結果表明,麻風樹JcHDZ28蛋白與擬南芥、玉米和水稻中的HD-Zip家族成員高度同源,且均含有高度保守的HD和LZ基序(圖1)。

Oshox1表示水稻中的HD-Zip家族蛋白;Zmhdz25表示玉米中的HD-Zip家族蛋白;AtHB2表示擬南芥中的HD-Zip家族蛋白。

2.2 JcHDZ28基因的表達模式分析

為了進一步研究JcHDZ28在植物生長發育中的作用,我們使用qRT-PCR分析了JcHDZ28基因在根、莖、葉、花和種子中的表達模式,結果表明,在所有被檢測的器官中都檢測到JcHDZ28的表達,且JcHDZ28基因在生殖器官(花和種子)中的相對表達量較高(圖2a)。我們進一步檢測了JcHDZ28基因在鹽脅迫下的表達模式,結果表明,JcHDZ28基因在鹽脅迫2 h、6 h、12 h和24 h的相對表達量均顯著低于鹽脅迫0 h的相對表達量,且鹽脅迫24 h的相對表達量相比鹽脅迫6 h、12 h有所提高(圖2b)。該結果進一步表明,JcHDZ28基因也許在植物響應鹽脅迫中起重要的調控作用。

a:JcHDZ28基因組織特異性表達;b: JcHDZ28基因在鹽脅迫條件下的表達模式分析。 **表示在鹽脅迫2 h、6 h、12 h、24 h與0 h相比差異極顯著(P<0.01)。

2.3 JcHDZ28蛋白的亞細胞定位

為了檢測JcHDZ28蛋白的亞細胞定位,我們構建了35S::JcHDZ28-GLosgfp融合表達載體。隨后將構建好的質粒連同35S::GFP質粒一起轉化到擬南芥原生質體細胞,在共聚焦掃描顯微鏡上獲得定位樣品的熒光圖像。結果(圖3)表明,35S::GFP質粒在所有細胞中都可以檢測到熒光信號,然而,35S::JcHDZ28-GFP質粒只在細胞核中檢測到了明亮的綠色信號。這些結果表明,JcHDZ28蛋白定位于細胞核中。

圖3 JcHDZ28蛋白亞細胞定位分析

2.4 轉JcHDZ28基因擬南芥表型分析

為了進一步研究JcHDZ28基因的功能,我們構建了過表達轉JcHDZ28基因擬南芥植株。RT-PCR結果表明,檢測到JcHDZ28基因在轉基因株系中高表達,在野生型中沒有檢測到表達(圖4a)。表型分析結果表明,過表達JcHDZ28不影響擬南芥地上部分生長發育(圖4b)。開花時間統計結果表明,轉JcHDZ28基因植株開花時間與野生型相比沒有顯著差異,表明過表達JcHDZ28不影響擬南芥開花時間(圖4c)。這些結果表明,JcHDZ28基因不影響轉基因擬南芥地上部分的生長和發育。

a:JcHDZ28基因在野生型擬南芥和轉基因擬南芥中的表達情況;b:轉JcHDZ28基因植株表型分析;c:轉JcHDZ28基因植株開花時間統計。 WT:野生型;OE1:轉JcHDZ28基因植株1號株系;OE2:轉JcHDZ28基因植株2號株系;OE3:轉JcHDZ28基因植株3號株系。

2.5 轉JcHDZ28基因擬南芥鹽脅迫抗性分析

qRT-PCR結果表明鹽脅迫抑制JcHDZ28基因的表達(圖2b),因此我們推測JcHDZ28也許參與植物對鹽脅迫的響應。為了證明這個假設,我們進一步檢測了野生型和轉基因植株對鹽脅迫的抗性。我們將消毒后的野生型和轉JcHDZ28基因植株直接點播到1/2 MS和含有100 mmol/L NaCl的1/2 MS培養基中生長20 d。結果表明,在鹽脅迫條件下,轉基因擬南芥植株大小明顯小于野生型擬南芥植株大小,葉片白化更嚴重(圖5a),存活率極顯著低于野生型擬南芥(圖5b)。生理指標測定結果表明,在鹽脅迫條件下,轉基因擬南芥植株葉片相對電導率極顯著高于野生型擬南芥(圖5c),脯氨酸含量極顯著低于野生型擬南芥(圖5d)。這些結果表明,過表達JcHDZ28降低了轉JcHDZ28基因植株對鹽脅迫的抗性。

a:野生型擬南芥和轉JcHDZ28基因擬南芥在正常生長和鹽脅迫(100 mmol/L NaCl)條件下的生長分析;b:成活率分析;c:相對電導率分析;d:脯氨酸含量分析。 WT:野生型;OE1:轉JcHDZ28基因植株1號株系;OE2:轉JcHDZ28基因植株2號株系;OE3:轉JcHDZ28基因植株3號株系。**表示在鹽脅迫條件下轉基因植株與野生型植株相比差異極顯著(P<0.01)。

2.6 鹽脅迫條件下非生物脅迫相關基因表達

為了進一步闡明JcHDZ28調控擬南芥響應鹽脅迫的分子機理,我們通過qRT-PCR技術檢測了SNAC1、AtCATA、LEA3、P5CS1等脅迫相關基因的表達。結果表明,在正常生長條件下,SNAC1、AtCATA、LEA3、P5CS1在野生型擬南芥和轉JcHDZ28基因擬南芥植株中的相對表達量沒有顯著差異,然而,在鹽脅迫條件下,這些基因在轉JcHDZ28基因擬南芥植株中的相對表達量顯著低于在野生型擬南芥中的相對表達量(圖6)。這些結果表明,鹽脅迫條件下,過表達JcHDZ28增加轉基因擬南芥對鹽脅迫的敏感性也許是通過改變這些非生物脅迫相關基因的表達引起的。

WT:野生型;OE1:轉JcHDZ28基因植株1號株系;OE2:轉JcHDZ28基因植株2號株系;OE3:轉JcHDZ28基因植株3號株系。

3 討 論

HD-Zip基因是植物特異性轉錄因子基因,這些轉錄因子基因在植物生長發育(如胚胎發生、分生組織調控等)和非生物脅迫(如高鹽、干旱等)過程中發揮重要的作用[1]。盡管許多HD-Zip轉錄因子基因在擬南芥、水稻和別的物種中的功能已經被闡述,但是HD-Zip基因在大戟科尤其是麻風樹中的研究較少。在本研究中,我們克隆了麻風樹JcHDZ28基因(1個HD-Zip家族基因的成員)并分析了該基因的功能,在擬南芥中超表達JcHDZ28增加了轉基因植物對鹽脅迫的敏感性。

前人研究結果表明,超表達HD-Zip家族基因能夠改變轉基因植物對非生物脅迫的抗性[12-15]。在水稻中,過表達HD-Zip家族基因增加了轉基因水稻對非生物脅迫的敏感性[15]。與此相似,在本研究中,轉JcHDZ28基因擬南芥在鹽脅迫條件下的植株大小和存活率均低于野生型擬南芥。前人研究結果表明,當植物遭遇非生物脅迫的時候,其體內的一些生理指標迅速變化使得植物能夠更好地應對這些極端環境條件[12-14]。因此,生理指標可以用來衡量植物對非生物脅迫的抗性。相對電導率是植物遭受逆境脅迫時其細胞膜損傷程度的重要評價因子[15]。本研究結果表明,轉JcHDZ28基因擬南芥在鹽脅迫條件下的相對電導率極顯著高于野生型擬南芥,該結果進一步表明,鹽脅迫對轉JcHDZ28基因擬南芥細胞膜的破壞程度顯著高于野生型擬南芥。脯氨酸能夠用來作為穩定劑降低高鹽、干旱等極端環境脅迫對植物的危害[16-17]。本研究結果表明,在鹽脅迫條件下,轉JcHDZ28基因擬南芥葉片脯氨酸的含量顯著低于野生型擬南芥,該結果進一步表明,在鹽脅迫條件下,脯氨酸也許是一個導致轉JcHDZ28基因擬南芥具有更高敏感性的因子。以上結果進一步表明,鹽脅迫對轉基因擬南芥的破壞程度顯著高于野生型擬南芥。

除了上述生理指標外,轉基因植物對鹽脅迫敏感性的增加也歸因于非生物脅迫響應基因的下調表達[18]。例如,HsfA3s通過降低非生物脅迫響應基因的表達增加了轉基因植物對鹽脅迫的敏感性[18]。與此類似,在我們的研究中,在鹽脅迫條件下,一些非生物脅迫應答基因 (SNAC1、AtCATA、LEA3和P5CS1)在轉基因擬南芥中的相對表達量顯著低于在野生型擬南芥中的相對表達量。綜上,過表達JcHDZ28降低了轉基因擬南芥對鹽脅迫的抗性可能是因為降低了非生物脅迫相關基因的表達。本研究結果將有助于我們進一步了解HD-Zip轉錄因子基因JcHDZ28在麻風樹中的生理功能。