丁酸鈉通過調節腸道通透性改善酒精性肝病小鼠炎癥的機制

田文妍， 張曉旭， 張麗娜， 郭米雪， 劉 健， 李 婷， 楊少奇

（1.寧夏醫科大學，銀川 750004； 2.寧夏醫科大學總醫院消化內科，寧夏醫科大學第一臨床醫學院，銀川 750004；3.寧夏醫科大學總醫院兒科，寧夏醫科大學第一臨床醫學院，銀川 750004； 4.寧夏醫科大學總醫院肝膽外科，寧夏醫科大學第一臨床醫學院，銀川 750004； 5.寧夏醫科大學基礎醫學院，銀川 750004）

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是由長期慢性飲酒引起的一系列肝臟疾病的總稱[1]。在重度ALD 中，30 d 病死率接近30%。激素及保肝藥物是主要的治療手段，但其生存獲益是短暫的。在激素無應答者中，早期肝移植仍然受到很大的限制[2]。因此，尋求安全、高效的方法是治療ALD 的必然趨勢。腸道屏障與其微生物群和肝臟的雙向關系是ALD 致病機制中的一個關鍵環節[3]。當腸道屏障受損時，腸道內微生物群及其產物，如內毒素（endotoxin，LPS）可易位經門靜脈入肝并加重炎性反應[4-5]。并且作為腸道來源病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），是機體炎性的重要觸發因素。飲酒可導致腸道微生物的組成發生顯著變化[6]，增加體循環及外周血的LPS 水平，但其具體機制尚不清楚。丁酸是腸道微生物發酵膳食纖維產生的短鏈脂肪酸的一種，已被證實在保護腸道屏障功能、調節免疫應答、改善脂質代謝等方面發揮著重要作用[7-8]。本課題組前期研究[9]表明，給ALD 模型小鼠喂養丁酸鈉（sodium butyrate，NaB），能夠有效抑制ALD 炎性反應。但是，NaB 如何通過腸—肝軸改善腸道通透性從而使炎性因子水平降低的機制尚不清楚，有待進一步研究。

本研究通過檢測腸道絨毛結構的改變、腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 的表達及炎性因子的表達水平，評價NaB 對ALD 小鼠腸道通透性及炎性因子的影響，以期為臨床防治ALD 提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雌性8 周齡C57BL/6J 小鼠60 只，體質量為（18±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，在寧夏醫科大學動物實驗中心SPF 級環境下飼養。所有動物實驗研究均通過寧夏醫科大學倫理委員會倫理審核（No.2020-053）。NaB（純度為99%）購自美國Sigma 公司；小鼠Lieber-De－Carli 液體飼料及其對照飼料購自南通特洛菲生物科技有限公司；ZO-1（sc-33725）、Occludin（sc-133256）一抗購自美國Santa Cruz 公司，ZO-1 二抗購自美國Abcam 公司（ab6840），Occludin 二抗（BST09K24C01）購自美國Boster 公司，LPS 檢測鱟試劑盒購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司；ELISA 試劑盒購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及分組 將60 只小鼠適應性喂養1 周后，隨機分為陰性對照組、NaB 干預對照組、ALD 模型組、NaB 干預模型組，每組15 只。根據文獻[10-11]的方法，對照組給予Lieber-DeCarli 對照液體飲食，模型組給予等熱量的Lieber-DeCarli 酒精液體飲食。同時，NaB 干預對照組給予含NaB（0.6 g·kg-1）的液體飲食喂養[12-13]。6 周后，麻醉小鼠，抗凝管收集小鼠外周血、肝臟及腸道組織。

1.2.2 腸道病理學組織的觀察 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色檢測腸道絨毛結構變化。實驗結束后，腸道組織用4%多聚甲醛固定，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明后嵌入石蠟。HE 染色腸道組織切片，在光學顯微鏡下觀察各組小鼠腸道組織形態的變化。

1.2.3 免疫熒光染色檢測腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 的表達 收集小鼠腸道組織，用4%多聚甲醛固定，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明后嵌入石蠟進行切片。將切片放入烘箱烤片大約1 h，立即放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ及梯度乙醇進行脫蠟，脫蠟后放入PBS 中清洗3 次，每次5 min。然后放入檸檬酸鉀修復抗原，加封閉液，37 ℃孵育1 h，孵育完用PBS 清洗3 次，每次5 min。洗后滴加一抗（ZO-1、Occludin）4 ℃孵育過夜。第2 天從冰箱取出復溫1 h，回收一抗，PBS 清洗3次，每次5 min。然后滴加熒光二抗，37 ℃避光孵育2 h，甩去二抗，PBS 清洗后加DAPI 封片。

1.2.4 肝臟、腸道及血漿LPS 的測定 按照鱟試劑盒說明書步驟檢測肝臟、腸道及血漿中LPS 的表達水平。

1.2.5 肝臟、腸道及血漿炎性因子水平的測定 按照ELISA 試劑盒說明書的操作步驟，檢測小鼠組織及外周血的白細胞介素（IL）-6、IL-1β、IL-17A的表達水平。

1.3 統計學方法

所有數據采用GraphPad Prism 9.0 軟件進行統計學分析。正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。采用Pearson 相關分析法分析腸道通透性與血漿炎性因子的相關性。P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腸道病理組織學形態

HE 染色結果顯示，與陰性對照組相比，ALD模型組結腸組織可見腸道絨毛結構明顯紊亂，固有層可見單個核細胞浸潤。與ALD 模型組相比，NaB 干預模型組腸絨毛結構有所改善，見圖1。

圖1 各組小鼠結腸組織HE 染色結果（HE×40）

2.2 NaB 干預增強ALD 小鼠腸道緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 表達水平

采用免疫熒光染色檢測結腸組織緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 的表達水平，結果顯示，與陰性對照組相比，ALD 模型組小鼠結腸組織中緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 的表達降低（P ＜0.05）；與ALD 模型組相比，NaB 干預模型組緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 表達水平升高（P＜0.05）。上述結果表明，NaB 通過增加腸道緊密連接蛋白表達來改善ALD 小鼠腸屏障的完整性，見圖2。

圖2 NaB 對小鼠結腸緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 表達水平的影響

2.3 NaB 干預減少ALD 小鼠血漿、肝臟及腸道的LPS 水平

與陰性對照組相比，ALD 模型組小鼠血漿、肝臟及腸道LPS 水平均升高（P 均＜0.05）；與ALD 模型組相比，NaB 干預模型組小鼠血漿、肝臟及腸道LPS 水平均降低（P 均＜0.05），見圖3。

圖3 NaB 干預對ALD 小鼠血漿、肝臟及腸道LPS 表達水平的影響

2.4 NaB 干預抑制ALD 小鼠血漿、肝臟及腸道炎性因子

與陰性對照組相比，ALD 模型組小鼠血漿、肝臟、腸道的IL-6、IL-1β、IL-17A 升高（P 均＜0.05）；與ALD 模型組相比，NaB 干預模型組小鼠血漿、肝臟、腸道的IL-6、IL-1β、IL-17A 均下降（P 均＜0.05），見圖4。

圖4 NaB 干預對小鼠血漿、肝臟及腸道炎性因子表達水平的影響

2.5 炎性因子水平與腸道緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 的Pearson 相關性分析

相關性分析結果顯示，在ALD 模型小鼠中，腸道緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 的降低與腸道炎性因子的水平存在負相關性，隨著緊密連接蛋白表達的降低，炎性因子水平升高。NaB 干預模型組小鼠中炎性因子的水平隨著腸道緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 表達升高而降低（P 均＜0.05），見圖5。

圖5 腸道緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 與腸道炎性因子IL-1β、IL-6、IL-17A、LPS 的相關性分析

3 討論

ALD 是一種代謝性肝病，其病理進展主要由慢性炎癥反應驅動，來自腸道微生物群及其產物的病原體相關分子模式LPS 易位到腸系膜淋巴系統和門靜脈循環，構成了一種感染的中心機制[14]。腸道微生態失調和腸道屏障完整性的受損是ALD 發病機制的重要因素，腸道通過膽道和門靜脈與肝臟連接，PAMPs 可直接通過腸—肝軸進入肝臟，激活促炎信號通路TLR4，導致促炎細胞因子IL-1β、IL-18 等釋放，從而加重ALD 小鼠的炎癥反應[15-16]。

腸道屏障是機體防止病原微生物及其產物進入體循環的第一道防線，而酗酒可破壞腸屏障完整性[17]。超過一半的酗酒者已被證實有腸道屏障功能障礙和腸道生態失調[18]，從而導致微生物進入體循環，這可能使ALD 小鼠的炎性反應進一步加重。本研究在經典的動物ALD 模型中，采用HE 染色及免疫熒光染色發現小鼠結腸絨毛結構明顯紊亂，腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 的表達減少，與上述研究結果一致，表明保持腸道屏障的完整性在預防ALD 中發揮重要作用。并且本實驗采用NaB 干預ALD 小鼠模型，發現腸道絨毛結構較ALD 模型組明顯改善，腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 的表達也有所升高，表明NaB 具有改善腸道屏障功能的能力，腸源性LPS 易位在乙醇引起的肝臟慢性炎癥中起著重要作用。有研究[19]表明，體外濃度在1～10 mmol·L-1的NaB 可改善E12 人結腸細胞功能。本研究發現，NaB 干預能夠減少ALD 小鼠腸道、肝臟及血漿中LPS 的含量，提示NaB 通過改善腸道屏障的通透性進而減少腸源性LPS 經過腸—肝軸進入肝臟，從而抑制ALD 小鼠的炎性反應。

在腸道炎性過程中產生的促炎細胞因子，具有重要的腸道緊密連接蛋白的調節作用。有研究[20]表明，IL-1β 誘導腸上皮緊密連接（intestinal epithelial tight junction，IETJ）的通透性增加是腸道炎癥的一個重要促進因素。腸道炎癥的加重會導致腸道微生物群的改變及腸道細菌的增加，而腸道微生物群的改變及其細菌產物可以激活免疫細胞來調節促炎細胞因子的表達，如腫瘤壞死因子（TNF-α）、IL-1β 和IL-6，這些促炎細胞因子反過來作用于緊密連接蛋白，增加屏障通透性[21]。前期研究[9]顯示，在ALD 模型組小鼠的血漿及肝臟中，IL-1β 及IL-6 升高，而給予NaB 后炎性因子表達顯著下降，改善了ALD 小鼠的炎癥反應。也有研究[22]證明干擾素（IFN-γ）、IL-17A在體外可迅速增加血腦屏障和腸上皮屏障的通透性。本研究檢測了血漿、肝臟及腸道IL-6、IL-1β、IL-17A，結果表明，ALD 模型組小鼠的腸道、肝臟及血漿IL-6、IL-1β、IL-17A 升高，而NaB干預模型組的IL-6、IL-1β、IL-17A 有所下降，與前期研究[9]結果一致。在此基礎上，對各組中的緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 的表達水平與腸道炎性因子IL-1β、IL-6、IL-17A 的相關性分析發現，緊密連接蛋白的表達水平與腸道炎性因子IL-1β、IL-6、IL-17A 的表達呈負相關，表明腸道通透性的增加導致腸道炎性反應加重，進而使腸道內有害物質經過腸—肝軸進入肝臟，導致ALD小鼠炎性反應進一步加重。給予NaB 后，ALD 模型組小鼠緊密連接蛋白表達升高，炎性因子水平表達降低，提示NaB 可通過增加緊密連接蛋白的表達來改善ALD 小鼠的炎癥反應[15]。

綜上所述，本研究在證實NaB 可改善ALD小鼠肝臟炎癥的基礎上，進一步探討其對腸道黏膜通透性的影響。NaB 通過增加腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 的表達來改善腸道通透性，從而減少腸源性LPS 經過腸—肝軸進入肝臟介導的炎性反應，進而發揮負調控作用，抑制ALD 的炎癥反應。NaB 作為一種潛在的安全、價格低廉、有效的干預劑，可能為臨床ALD 防治提供新的選擇。