負載碳酸鈣的水包油包固乳液穩定性及相互作用研究

李功偉,張杰,郝佳,趙伊聰,許朵霞,曹雁平

(北京工商大學 食品與健康學院,北京市食品添加劑工程技術研究中心,北京,100048)

鈣是人體內最豐富的礦物質元素,對于維持人體生理平衡及健康起著關鍵作用[1]。全球平均膳食鈣攝入量分布顯示許多國家膳食鈣攝入量都相對較低[2]。碳酸鈣(CaCO3)具有成本低、鈣含量高的優勢,是目前國內外常用的強化鈣[3]。因此,在食品領域,乳粉以添加碳酸鈣為主,且市面上補鈣產品多為碳酸鈣。然而,碳酸鈣作為一種難溶性鈣鹽在食品體系中存在分散穩定性差,貯藏過程中易析出的問題。因此,如何提高碳酸鈣在液態食品中的分散穩定性受到了國內外學者的廣泛關注[4-5]。

水包油包固(solid-in-oil-in-water,S/O/W)三相載體乳液作為食品營養素的載體,具有制備成本低、工藝簡單等優點。目前國內外基于S/O/W技術對酶制劑、益生菌載體構建方面已有報道,但對營養素的保護研究較少。ZHANG等[6]將乳糖酶噴霧干燥形成粉末,基于S/O/W技術形成微球提高乳糖酶活性,乳糖酶穩定性較傳統乳狀液得到顯著提高;WEI等[7]研究負載咖啡酸苯乙酯的S/O/W乳液,有效地將咖啡酸苯乙酯遞送至結腸,并實現12 h的延遲釋放,提高了其生物利用度和活性。

黃原膠(xanthan gum, XG)是一種陰離子胞外多糖,能夠與水分子結合形成氫鍵從而起到增稠效果,因此可用于增加乳液黏度來提高乳液穩定性[8]。海藻酸丙二醇酯(propylene glycol alginate, PGA)是一種兩親性陰離子多糖,分子鏈中的糖醛酸具有親水性,丙二醇基團具有親油性,有較好的界面活性[9]。因此,將PGA與XG復凝聚可改善乳液的界面活性和流變特性,從而提高S/O/W乳液的穩定性。

本文以PGA和XG復合物為基質,研究二者復配界面活性及相互作用方式?；赟/O/W技術構建負載碳酸鈣的S/O/W鈣-脂質乳液,系統分析乳液穩定性、微觀結構、流變特性。研究結果可豐富構建S/O/W傳遞系統理論,為開發新型營養素輸送載體提供理論和技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

輕質碳酸鈣,鄭州雙騰實業有限公司;精制豬油,臨沂新程金鑼肉制品集團有限公司;PGA(純度大于98%),上海源葉生物科技有限公司;XG(純度大于99.5%),北京索萊寶科技有限公司;氟羅里硅土,上海麥克林生化科技股份有限公司;尼羅紅、卡爾科弗盧爾熒光增白劑,Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

Smart-N超純水機,力新儀器(上海)有限公司;Eutech pH 700 測量儀,美國Eutech公司;TB-214分析天平、TB-1102電子天平,美國Denver Instrument公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,河南省予華儀器有限公司;H/T16MM高速常溫離心機,湖南赫西儀器裝備有限公司;T-25 digital高速分散機,艾卡(廣州)儀器設備有限公司;Attension Theta Flex 光學接觸角儀,瑞典百歐林科技有限公司;LUMiSizer穩定性分析儀,羅姆(江蘇)儀器有限公司;Zetasizer Nano ZS90納米粒度電位儀,上海思百吉儀器系統有限公司;Mars iQ Air HAAKE哈克流變儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;尼康AX共聚焦顯微鏡,尼康儀器(上海)有限公司;Microtrac S3500激光粒度儀,美國Microtrac公司;SU8020場發射掃描電鏡,日本Hitachi公司;iS10 FTIR光譜儀,美國Nicolet公司;D8 Advance X射線衍射儀,德國Bruker公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 PGA和XG溶液的制備

分別稱取一定質量的PGA粉末、XG粉末與磷酸鹽緩沖溶液(PBS)混合,在50 ℃水浴攪拌2 h,之后在4 ℃過夜水合,確保其充分溶解,獲得質量分數為0.6%的PGA溶液和XG溶液。

將制備得到的PGA溶液和XG溶液按0∶6、1∶6、2∶6、3∶6、4∶6、5∶6、6∶6(質量比)的比例復配,在50 ℃磁力攪拌2 h,獲得總碳水化合物質量分數為0.6%不同PGA-XG配比的溶液。

1.3.2 精制豬油的純化

實驗采用精制豬油作為油相。由于市售豬油存在少量抗氧化劑和其他雜質,在實驗前我們對其進行純化以避免對實驗結果造成影響。參考GAONKAR[10]的方法并稍作修改,純化步驟如下:將氟羅里硅土按照3%(質量分數)的比例添加到融化的豬油中,70 ℃水浴攪拌2 h后,10 000 r/min離心20 min去除沉淀。隨后重新加入氟羅里硅土反復操作,直至20 min內PBS在純化豬油界面的表面張力沒有明顯變化。純化后油相的密度為0.833 3 g/cm3,PBS在油水界面的表面張力為(36.79±0.77) mN/m。

1.3.3 油水界面表面張力的測量

采用懸滴法測量油水界面的表面張力[11]。將不同PGA-XG配比的溶液加入外徑為2.08 mm的注射器中并排出氣泡,然后將針頭插入裝有純化豬油的矩形石英比色皿。隨后,每個樣品擠出12 μL至針尖并用自動進樣裝置將樣品壓成完整的滴狀。攝像機系統立即連續捕捉液滴輪廓的變化,使用楊-拉普拉斯方程實時計算不同時間點樣品的表面張力,整個過程持續20 min。實驗過程中盡量避免外部振動的干擾,所有樣品重復3次。

1.3.4 S/O/W鈣-脂質乳液制備

S/O/W鈣-脂質乳液的制備參考LI等[12]的方法并稍作修改。將食品級碳酸鈣與70 ℃加熱融化后的豬油按1∶10(質量比)的比例混合,在30 ℃磁力攪拌1 h,獲得均一的S/O相。隨后,分別移取5%(質量分數)S/O相加入1.3.1節制備的不同PGA-XG配比的W相溶液,15 000 r/min下高速剪切5 min,獲得S/O/W鈣-脂質乳液。

1.3.5 S/O/W鈣-脂質乳液穩定性分析

采用LUMiSizer穩定性分析儀,通過STEP-Technology快速測定乳液的穩定性。不穩定性指數(instability index)是在離心的過程中,近紅外光照射在樣本試管上,通過記錄樣品不同位置的透射率分布的變化,而確定乳液中顆粒的遷移過程。實驗過程中,取乳液約0.4 mL,均勻注射至樣品試管底部,溫度設定為25 ℃,離心轉速4 000 r/min,樣品的透射率的特征線每60 s記錄一次,共255次。

1.3.6 S/O/W鈣-脂質乳液Zeta-電位測量

用PBS將新鮮制備的乳液稀釋400倍,于25 ℃下進行Zeta-電位的測定。平衡時間120 s,以3次測量結果的平均值來表示。

1.3.7 S/O/W鈣-脂質乳液表觀黏度測量

采用CC27型號轉子在25 ℃,剪切速率0.1～200 s-1條件下對乳液進行剪切測試,獲得不同剪切速率下乳液的表觀黏度。

1.3.8 S/O/W鈣-脂質乳液激光共聚焦顯微鏡觀察

乳液染色參考DU LE等[13]的方法并稍作修改。取1 mL新鮮制備的乳液加到10 mL離心管,隨后加入200 μL卡爾科弗盧爾熒光增白劑(激發波長405 nm)和20 μL尼羅紅[質量濃度為1 g/L的二甲基亞砜溶液,激發波長488 nm]染料,旋渦10 s,平衡1 h,分別對PGA-XG復合物和油脂染色。吸取10 μL染色乳液滴加至載玻片,緩慢蓋上蓋玻片,避免產生氣泡,隨后使用60倍油鏡對乳液進行觀察,獲取其微觀結構。

1.3.9 S/O/W鈣-脂質乳液粒徑分布測量

使用S3500激光粒度儀在25 ℃下對乳液粒徑分布進行測量,樣品以水(折射率1.33)為介質輸送至測量單元,重復3次。

1.3.10 PGA-XG復凝聚結構表征

1.3.10.1 激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)

采用1.3.8節的方法對不同PGA-XG配比的溶液進行染色,并進行激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3.10.2 掃描電鏡形貌觀察

將單一的PGA溶液、XG溶液和PGA-XG復凝聚溶液凍干,隨后使用場發射掃描電鏡觀察樣品的表觀形貌。

1.3.10.3 傅里葉變換紅外光譜測量

采用紅外光譜儀對冷凍干燥后的樣品進行紅外光譜測量。波數范圍400～4 000 cm-1,信躁比是50 000∶1, 掃描32次,記錄各樣品的紅外光譜。

1.3.10.4 X射線衍射分析

采用X射線衍射儀對冷凍干燥后的樣品進行X射線衍射分析。管電流40 mA,管電壓40 kV,光譜范圍5°～50°,掃描速率2°/min,記錄各樣品的X射線衍射圖譜。

1.4 數據統計與分析

實驗所有樣品測量都至少重復3次,結果以測量值的平均值±標準差表示。采用SPSS 17.0軟件對數據進行單因素方差分析(ANOVA)和鄧肯檢驗(P<0.05),使用Origin 2022b軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 不同PGA/XG復配比在油水界面的表面張力分析

油相和水相界面層的穩定性是影響乳液穩定性的一個重要因素,油水界面表面張力越小,界面層則越穩定[14]。因此,比較了單一XG和不同PGA/XG復配比在油水界面的表面張力。如圖1所示,純化豬油中PBS的表面張力為(36.79±0.77) mN/m。XG在純化豬油中的表面張力為20.36 mN/m,這是因為XG的疏水鍵較少,界面活性相對較低。然而,PGA和XG復配之后大幅降低了油水界面的表面張力,這是因為PGA是兩親性化合物,其分子中的丙二醇基團可以與油脂結合,糖醛酸具有的親水末端含有大量羥基和部分羧基,可與XG結合[15]。ZHU等[16]研究表明氫鍵或疏水相互作用對界面張力的降低可能是油相和水相形成穩定界面層的原因。因此,PGA和XG復合物有助于維持油相和水相界面層的穩定性。

圖1 不同PGA/XG復配比在油水界面的表面張力Fig.1 Interfacial tension of PGA/XG complex with different ratios at the oil-water interface

2.2 不同PGA/XG復配比制備S/O/W鈣-脂質乳液穩定性

圖2-a顯示了測試過程中乳液樣品不同位置的原始透射曲線,從圖中可以看出單一XG、PGA-XG(5∶6)和PGA-XG(6∶6)3個樣品有輕微碳酸鈣沉淀以及乳析現象的發生。根據透射率的變化計算得到乳液樣品的不穩定指數如圖2-b所示。根據不穩定指數可將樣品區分為3個區域,單一XG、PGA-XG(1～4∶6)和PGA-XG(5∶6和6∶6)。隨著PGA比例的增加,乳液不穩定指數先減小后增加,在PGA-XG(4∶6)之后發生徒長,第一區域至第二區域變化的原因可能是由于單一XG在油水界面表面張力較大,表面活性較低,PGA加入后改善了油水界面層的穩定性。第二區域至第三區域變化的原因可能是過高的PGA占比減少了連續相的黏度,因此在乳液測試過程中不足以維持分散相粒子的穩定[17]。

2.3 不同PGA/XG復配比制備S/O/W鈣-脂質乳液Zeta-電位

圖3為不同PGA/XG復配對制備S/O/W鈣-脂質乳液Zeta-電位的影響情況,可以看出不同PGA與XG配比制備的乳液都具有較低的負電荷,這是因為2種陰離子多糖自身帶電性質所決定,不同乳液樣品電位值無顯著差異,這表明所有樣品中由電荷產生的顆粒靜電斥力相似。

圖3 不同PGA/XG復配比制備乳液的Zeta-電位Fig.3 Zeta-potential of emulsions prepared by PGA/XG complex with different ratios

2.4 不同PGA/XG復配比制備S/O/W鈣-脂質乳液剪切流變特性

如圖4-a所示,不同PGA/XG復配比制備S/O/W鈣-脂質乳液的表觀黏度均隨著剪切速率的增加而減小,顯現出剪切稀化現象。這是由于乳液中含有大量絮狀顆粒以及XG分子的假塑性,在高剪切速率下乳液中網絡結構斷裂以及液滴變形所導致[18]。圖4-b顯示了不同乳液樣品的初始表觀黏度,隨著PGA比例的增加,乳液表觀黏度降低,這是因為體系的黏度主要是連續相中XG分子鏈纏結所形成,過高的PGA比例造成乳液體系黏度值大幅下降,不利于維持乳液的穩定性,這與2.2節的結果一致。

2.5 不同PGA/XG復配比制備S/O/W鈣-脂質乳液微觀結構

如圖5所示,單一XG制備的乳液具有較大的液滴尺寸,PGA與XG復凝聚后制備的乳液液滴均減小,這可能是由于PGA與XG復配后有較好的界面活性,阻礙了油滴間的聚集。復配W相乳液樣品隨著PGA比例的增加,乳液液滴尺寸先減小后略微增加,這可能是由于更小的液滴具有更大的比表面積,高速分散過程中XG含量不足以覆蓋油滴表面所導致[19]。此外,我們可以觀察到在部分油滴內部有黑色陰影,推測這是附著在油滴內部的碳酸鈣,這與之前報道的有關花青素的研究相類似[20]。

a-復合圖像;b-卡爾科弗盧爾熒光增白劑染色W相;c-尼羅紅染色O相

2.6 不同PGA/XG復配比制備S/O/W鈣-脂質乳液粒徑分布

為了更好地佐證CLSM觀察到的乳液微觀結構,采用S3500激光粒度儀對其進行了粒度分布測量。如圖6所示,單一XG制備乳液平均粒徑較大,約12.66 μm,且粒徑分布曲線峰形較寬。隨著PGA的加入,乳液粒徑分布曲線變窄,這表明PGA與XG復配制備乳液的液滴大小更加均一。復配W相乳液樣品隨著PGA比例的增加,乳液粒徑分布曲線先向左移后又輕微右移,這表明復配W相乳液樣品平均粒徑先減小后增加,PGA-XG(4∶6)乳液的平均粒徑約1.59 μm,這與激光共聚焦顯微鏡觀察到的結果一致。

圖6 不同PGA/XG復配比制備乳液的粒徑分布Fig.6 Particle size distribution of emulsions prepared by PGA/XG complex with different ratios

2.7 PGA-XG復凝聚結構表征

為了進一步探究PGA與XG復合物的結構特性以及相互作用方式,采用激光共聚焦顯微鏡、掃描電鏡、傅里葉變換紅外光譜、X射線衍射對復凝聚后的W相進行了表征。

2.7.1 激光共聚焦顯微鏡

圖7顯示了不同PGA/XG配比復凝聚后的微觀結構。單一的XG分子成鏈狀,PGA與XG復配后,PGA分子基于XG的分子鏈進行附著,二者發生了相互作用。不同配比下相互作用程度不同,隨著PGA含量的增加,二者形成的半互穿網絡結構先增強后減弱[21]。這可能是由于不同配比下2種多糖聚合物分子基團平衡結果不同所導致的[22]。

圖7 不同PGA/XG復配比CLSM圖像Fig.7 CLSM images of PGA/XG complex with different ratios

2.7.2 掃描電鏡

基于不同PGA/XG復配比制備乳液的不穩定指數在PGA-XG(4∶6)之后發生徒長,采用掃描電鏡對單一PGA、XG和PGA-XG(4∶6)的表觀形貌進行了觀察。如圖8所示,單一XG呈現出有孔洞的云狀或片狀,且表面相對粗糙;單一PGA呈現出長絲網狀。二者復配后呈現出致密的片狀結構,孔洞消失且表面光滑。說明二者通過相互作用形成了互補結構。

a-30×;b-100×;c-500×

2.7.3 傅里葉紅外光譜

圖9 PGA、XG和PGA-XG(4∶6)的傅里葉紅外光譜Fig.9 Fourier transform infrared (FTIR) spectra of PGA, XG, and PGA-XG (4∶6) complex

2.7.4 X射線衍射

圖10顯示了單一XG、PGA、PGA和XG復凝聚后的X射線衍射圖譜,可以看出,XG衍射峰為18.67°、30.04°、40.31°,PGA的衍射峰為13.32°、30.04°、40.31 °。2種多糖都顯示出較寬的衍射峰,這表明二者都是無定形結構。當PGA與XG復凝聚后,XG的結晶區域減小,結晶峰變窄。這表明二者存在相互作用,PGA的加入打破了XG原有的結構,使得XG結晶度下降。ZHENG等[24]證實原花青素與直鏈淀粉通過氫鍵結合,造成了大米淀粉結晶度下降,這與傅里葉紅外光譜結果相一致。

圖10 PGA、XG和PGA-XG(4∶6)的 XRD圖譜Fig.10 X-ray diraction (XRD) patterns of PGA, XG, and PGA-XG (4∶6) complex

3 結論

PGA與XG復配提高了XG在油水界面的表面活性,降低了表面張力,二者以氫鍵相互作用,進而形成網絡結構。以PGA與XG不同復凝聚比為W相,制備了負載碳酸鈣的S/O/W鈣-脂質乳液,當PGA與XG配比為4∶6時,乳液具有較好的穩定性和流變學特性。微觀結構及粒徑分布表明,乳液液滴分布均一,碳酸鈣位于O相內部。因此,通過S/O/W體系提高了碳酸鈣的分散穩定性,實現了食品固相(Solid,S)、油相(Oil,O)與水相(Water,W)的三相均一化。對于純碳酸鈣而言,胃中釋放速率較快,可能對胃產生刺激。因此,可在后續研究負載碳酸鈣的S/O/W鈣-脂質乳液體外模擬消化胃液轉化Ca2+動力學以及鈣的生物可及性,解析S/O/W鈣-脂質乳液的消化特性及控釋規律。