乳酸菌肽聚糖的提取純化及其對河豚毒素的毒性消減效果研究

劉暢,王嫦娥,盧瑛*

1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306)2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海,201306) 3(農業農村部國家淡水水產品加工技術研發分中心(上海),上海,201306)

肽聚糖(peptidoglycan,PG)廣泛存在于原核生物當中,作為細胞的“骨架”,為維持細胞形狀和完整性起到關鍵作用[1]。肽聚糖是革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌細胞壁中唯一共有的成分,且在革蘭氏陽性細胞的細胞壁中占有更大比例[2-3]。肽聚糖是一個動態的高分子物質[4],其合成過程十分繁瑣,需要多種蛋白質和酶參與調控,不同類型細菌的肽聚糖所涉及的生物合成方式也有所不同,這是肽聚糖結構復雜的直接原因[5-6]。復雜的結構和肽聚糖繁多的功能,在藥物研發[7]、生物信號[8]以及生物材料[9]等領域都是經久不衰的研究熱點[10]。

課題組前期研究發現,乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)對河豚毒素具有消減作用,發現肽聚糖是乳酸菌消減河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)的關鍵組分,并且不同類型乳酸菌對TTX的消減效果具有差異,推測可能是肽聚糖類型不同的影響[11-12]。由于現有的肽聚糖提取方法時間長,存在一定的安全隱患,并且未考慮不同類型肽聚糖帶來的差異性,為后續試驗帶來一定的困擾。因此,本研究旨在以3種肽聚糖結構不同的菌株[1][糞腸球菌(Enterococcusfaecalis,EF):A3α,植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,N115):A1γ,棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformis,I3):A4α]為研究對象,對磷壁酸、脂質和蛋白質的去除方法進行優化和改良,建立高純度肽聚糖的提取制備方法,并進一步通過定量檢測和毒理實驗考察了純化后的肽聚糖對TTX含量和毒性的消減效果,為肽聚糖的工業化制備及其對河豚毒素的毒性消減作用機制研究提供基礎數據和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

EF、N115、I3由上海海洋大學分子生物學實驗室保藏;TTX標準品(>99%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS),上海生工生物有限公司;鏈酶蛋白酶,北京索萊寶科技有限公司;胰蛋白酶,Sigma-Aldrich中國公司。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,上海力辰邦西儀器科技有限公司;CR-GIII高速冷凍離心機, 日本日立公司;HS-3垂直混合器,寧波新芝生物科技股份有限公司;PL2002電子天平,瑞士梅特勒托利多儀器(上海)有限公司;QB-8002微孔板振蕩器,海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 滅活乳酸菌體的制備

選取凍存的EF、N115和I3三種乳酸菌,在MRS培養基中活化3次后,于MRS肉湯中培養至對數期,沸水浴1 h滅活,PBS洗滌3次后離心取沉淀備用(6 000 r/min,10 min)。

1.2.2 肽聚糖純化方法優化

1.2.2.1 磷壁酸的去除條件優化及含量測定

稱取菌泥0.1 g(濕重)分別進行以下處理:加入5 mL 2%(體積分數)曲拉通X-114溶液(50 mmol/L pH 6.5 Tris-HCl),4 ℃攪拌過夜[13];加入5 mL的正丁醇,25 ℃攪拌30 min[14];加入5 mL 100 g/L TCA溶液,沸水浴1 h[15]。經過上述處理后的菌泥用去離子水洗滌3次,離心取沉淀(6 000 r/min,10 min),采用鉬酸銨法測定樣品中的磷含量,每組平行3次。

1.2.2.2 脂質的去除試劑優化及含量測定

稱取菌泥0.1 g(濕重)分別進行以下處理:加入5 mL 50 g/L SDS溶液,混勻后沸水浴25 min,離心后重懸于5 mL 50 g/L SDS溶液,沸水浴15 min,去離子水洗滌至無泡沫[3];加入5 mLV(乙酸鈉)∶V(氯仿)∶V(甲醇)=4∶5∶10溶液,37 ℃振蕩24 h;加入5 mL 丙酮,37 ℃振蕩24 h。采用香草醛法測定樣品中的脂質含量,每組平行3次。

1.2.2.3 蛋白質的酶解方法優化及含量測定

稱取菌泥0.1 g(濕重)分別進行以下處理:加入5 mL 3 mg/mL胰蛋白酶溶液(0.1 mol/L,pH 7.5,Tris-HCl),37 ℃搖床振蕩8 h;加入5 mL 1 mg/mL 鏈酶蛋白酶溶液(0.1 mol/L,pH 7.5,Tris-HCl,5 g/L SDS),60 ℃孵育2 h;使用兩種酶聯合處理。采用BCA蛋白定量試劑盒測定樣品中的蛋白質含量,每組平行3次。

1.2.3 肽聚糖制備

參照本研究優化后的方法,向滅活菌體中加入100 g/L TCA溶液,沸水浴1 h。取沉淀加入50 g/L SDS溶液,沸水浴25 min,沉淀重懸于50 g/L SDS溶液中,沸水浴15 min,洗滌至無泡沫。加入1 mg/mL 鏈酶蛋白酶溶液,60 ℃孵育2 h,再向沉淀加入5 mL 3 mg/mL胰蛋白酶溶液,37 ℃搖床振蕩8 h。透析72 h,凍干后備用。

1.2.4 肽聚糖表征

1.2.4.1 肽聚糖特異性表征

取肽聚糖標準品、EF(A3α)、N115(A1γ)、I3(A4α)的肽聚糖凍干樣,配制成1 mg/mL的溶液,測定200～700 nm處紫外吸收波長。向肽聚糖中加入200 μg/mL溶菌酶溶液(0.01 mol/L,pH 6.2 PBS)至終質量濃度為1 mg/mL,置于37 ℃搖床,間隔1 h測定450 nm處的吸光度,繪制變化曲線。

1.2.4.2 肽聚糖的結構表征

將肽聚糖凍干粉噴金后,置于掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)下觀察。

1.2.5 肽聚糖對TTX的消減率測定

將TTX標準品用0.1%(體積分數)乙酸溶液配制成1 mg/mL的溶液,將5 mg 滅活菌株和肽聚糖凍干樣與20 μg TTX混合至總體積為1 mL,37 ℃恒溫搖床(200 r/min)混合消減1 h,離心取上清液(12 000 r/min,3 min),參考國標GB 5009.206—2016《食品安全國家標準 水產品中河豚毒素的測定》進行競爭性酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)實驗。

競爭性ELISA樣品中TTX的抑制率和消減率按照公式(1)和公式(2)計算:

(1)

(2)

式中:A陽性,陽性孔的OD值;A樣品,樣品孔的OD值;A陰性,陰性孔的OD值。

1.2.6 肽聚糖對TTX毒性的消減效果

動物實驗采用昆明小鼠(19～21 g),購自上海杰思捷實驗動物有限公司(中國上海)。所有實驗程序均按照《實驗動物護理和使用指南》進行。小鼠在實驗前喂養3 d,在控制溫度(20～25 ℃)下自由飲水。TTX毒性評價采用GB 5009.206—2016《食品安全國家標準 水產品中河豚毒素的測定》內的小鼠生物法。各實驗組3只小鼠,后腹腔分別注射滅活菌株和肽聚糖處理TTX后的上清液1 mL。記錄注射起始時間和小鼠死亡時間。TTX毒性根據各組平均死亡時間測定,平均死亡時間從注射后至小鼠停止呼吸計算。

1.2.7 數據處理與分析

實驗結果采用平均值±標準偏差表示,由SPSS Statistics 23.0軟件進行顯著性分析,由Graphpad Prism 9.0.0軟件進行制圖。

2 結果與分析

2.1 肽聚糖的提取純化工藝優化

2.1.1 磷壁酸的去除條件優化

研究表明,氫氟酸處理是常用的去除細菌中磷壁酸的方法[3],但氫氟酸腐蝕性強且極易揮發,存在安全隱患。為了找到更為安全且適用于多種類型肽聚糖的去除磷壁酸試劑,以3種具有不同類型肽聚糖的乳酸菌(EF:A3α型;N115:A1γ型、I3:A4α型)中磷含量為指標,考察了3種較為溫和的試劑(100 g/L TCA,正丁醇,曲拉通X-114)對磷壁酸去除效果的影響。如圖1所示,采用100 g/L TCA處理1 h后的3種菌株肽聚糖的磷含量降低最為顯著,比對照組降低了93.5%以上;而正丁醇和曲拉通處理組的肽聚糖磷含量殘留較多,下降范圍為2.18%～45.27%。因此,本實驗選取100 g/L TCA沸水浴處理1 h作為磷壁酸去除條件。

圖1 不同處理方式對3種乳酸菌肽聚糖中磷含量的影響Fig.1 Effect of different treatment methods on phosphorus content in peptidoglycan of three LAB strains

2.1.2 脂質的去除試劑優化

研究顯示混合有機試劑[V(乙酸鈉)∶V(氯仿)∶V(甲醇)=4∶5∶10]可以去除菌體中的脂質,但其處理過程耗時長,且氯仿試劑較為危險[16]。因此,本研究選擇了相對安全的50 g/L SDS和在脫脂中廣泛使用的丙酮作為實驗組進行比較。結果如圖2所示,經過50 g/L SDS、丙酮以及混合試劑處理后,3種肽聚糖的脂質含量降至54.56～78.09 mg/g,其中50 g/L SDS處理對菌體的脂質去除率為64.13%～70.68%。表明3種試劑的脂質去除效果無顯著差異,且對不同類型肽聚糖中的脂質均有較好的去除效果。但丙酮和混合有機試劑均需處理24 h,而50 g/L SDS僅需處理40 min,故選取50 g/L SDS作為去除脂質的方法。

圖2 不同試劑對3種乳酸菌肽聚糖中脂質含量的影響Fig.2 Effects of different reagents on the lipid content of peptidoglycan in three LAB strains

2.1.3 蛋白質的酶解方法優化

胰蛋白酶和鏈霉蛋白酶是目前常用的去除肽聚糖上共價結合蛋白的2種酶[17]。胰蛋白酶作為一種肽鏈內切酶,可以特異性的作用于賴氨酸和精氨酸上的羧基,而鏈霉蛋白酶則作為一種復合酶,非特異性的切斷肽鍵。本研究對比了胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶以及2種酶的聯合使用對蛋白質的去除效果結果如圖3所示?？梢钥闯鰧τ贓F和I3,兩種酶聯合處理后的蛋白質含量最低,分別為416.72 mg/g和340.29 mg/g,下降了73.28%和67.03%;而N115的聯合處理后蛋白質含量(475.87 mg/g)卻與單獨酶處理后的蛋白質含量接近,無顯著性區別;由此可見,在選擇酶的種類時需要考慮肽聚糖類型的差異?？傮w來說,兩種蛋白酶的復合處理對肽聚糖中蛋白質的去除率優于單一酶處理方式。

圖3 不同酶解方式對3種乳酸菌肽聚糖中 蛋白質含量的影響Fig.3 Effect of different enzymatic hydrolysis methods on the protein content of peptidoglycan in three LAB strains

2.2 三種肽聚糖的鑒定及其生物學活性分析

2.2.1 肽聚糖的純度分析與鑒定

為驗證去除磷壁酸、脂質和結合蛋白后的肽聚糖純度,制備的3種肽聚糖樣品與肽聚糖標準品的紫外吸收波譜結果如圖4-a所示,3種乳酸菌的肽聚糖與肽聚糖標品的峰形在200～700 nm內基本一致,分別在230、260 nm處有特征吸收峰,無其他雜質吸收峰,表明采用優化后制備的肽聚糖純度較高。

溶菌酶可以斷裂肽聚糖糖鏈上的β-1,4糖苷鍵,因此可以通過溶菌酶實驗確定肽聚糖的糖鏈在提純過程中是否被破壞,如圖4-b所示,3種肽聚糖在溶菌酶處理后,其在450 nm處的吸光值在30 min內顯著下降,在1～4 h后趨于平緩,且溶液逐漸澄清,表明肽聚糖樣品已被完全酶解。由此可見,制備所得3種肽聚糖的糖鏈結構完整。

a-紫外全波長掃描圖;b-溶菌酶酶解實驗圖

純化制備的A3α型、A1γ型和A4α型肽聚糖的SEM圖像如圖5所示,3種肽聚糖均呈現較為統一的球狀形態,完整性較好,表明肽聚糖提取時采用的TCA、SDS和復合蛋白酶處理不會對肽聚糖的球殼外形造成明顯損傷,推測優化建立的提取純化方法對肽聚糖的活性影響應該比較小。

a-EF-PG;b-N115-PG;c-I3-PG

2.2.2 肽聚糖對TTX含量的影響作用

前期研究發現肽聚糖是乳酸菌消減TTX的關鍵組分[11],為考察肽聚糖的提取純化工藝是否會影響乳酸菌對TTX的消減作用,本研究采用ELISA分析了3種滅活菌體和肽聚糖分別處理前后的TTX含量變化。如圖6-a所示,TTX經3種滅活菌體處理后,其含量下降幅度為81.20%～85.06%,經3種肽聚糖處理后的下降范圍為78.51%～81.88%,由此可見,純化后的3種肽聚糖對TTX的消減作用與乳酸菌處理效果接近,表明優化后的提取純化工藝不影響肽聚糖的生物活性。

2.2.3 肽聚糖對TTX毒性的消減效果

經過滅活乳酸菌和肽聚糖處理后TTX的含量明顯下降,為進一步評價肽聚糖對TTX毒性的影響作用,本研究利用小鼠生物法分析了3種滅活乳酸菌和肽聚糖對TTX的毒性消減作用,如圖6-b所示,滅活后的3株乳酸菌對TTX毒性的消減效果最佳的是I3菌株,消減率為87.65%,其肽聚糖(A4α型)對TTX的毒性消減效果也最好,消減率為93.02%,另外2種肽聚糖(A3α和A1γ型)對TTX毒性的消減效果也較好,分別為87.30%和89.42%。綜上,制備所得3種肽聚糖對TTX的毒性和含量的消減效果均較好。

a-含量消減率;b-TTX毒性消減率

3 討論與結論

目前已有許多肽聚糖提取相關的研究,PASQUINA-LEMONCHE等[3]使用氫氟酸去除磷壁酸,這種方法對肽聚糖結構的損傷較小,但氫氟酸具有強揮發性和腐蝕性,危險性較大。SCHLEIFER等[1]首先使用TCA去除乳酸菌細胞壁上的磷壁酸,TCA較氫氟酸安全性更高,但長時間的TCA處理會損傷肽聚糖的結構。為減少TCA對肽聚糖結構的破壞,付艷茹等[18]探究了不同質量分數的TCA以及不同處理時間和溫度對乳酸菌細胞壁中磷壁酸的去除效果,結果發現100 g/L TCA在70 ℃下處理1 h可以達到最佳的去除效果,在提高TCA對磷壁酸去除效率的同時減少了對肽聚糖結構的破壞。本研究在此基礎上用100 g/L TCA對不同類型的肽聚糖進行處理,發現100 g/L TCA處理對不同類型肽聚糖中的磷壁酸均有顯著去除效果。除此之外,還有一些新型的去除磷壁酸的試劑[19],如曲拉通X-114和正丁醇,本實驗選用了這兩種新型試劑與TCA進行對比實驗,結果表明在用量相同的情況下,曲拉通X-114和正丁醇并不能達到100 g/L TCA的去除效果,但這兩種處理方法更加溫和,依然具有一定的應用前景。

SDS、丙酮以及氯仿混合溶劑均為去除脂質的常用試劑,其中SDS[20]和氯仿混合試劑[21]已經在肽聚糖的提取中得到應用,而丙酮還尚未有相關報道。本研究發現3種試劑在相同用量下表現出類似的脂質去除效果,但SDS對比氯仿和丙酮具有較高的安全性,且處理時間最短,因此選擇SDS作為肽聚糖提取過程中的脂質去除試劑。不同種類的蛋白酶對肽聚糖上結合蛋白的去除效果已有很多報道,楊媛等[22]使用胰蛋白酶和α-糜蛋白酶對嗜酸乳桿菌細胞壁上的結合蛋白進行酶解來提純肽聚糖。還有研究比較了胰酶、胰酶加堿性蛋白酶和胰酶加核酶3種處理方法對嬰兒雙歧桿菌的蛋白去除效果,結果發現胰酶加堿性蛋白酶為最佳處理組合[18]。但這些研究僅使用了一種乳酸菌進行研究,并未考慮肽聚糖種類不同的情況下不同的蛋白酶選擇,本研究以3種肽聚糖類型不同的乳酸菌為研究對象,發現肽聚糖類型會顯著影響蛋白酶的酶解效果。因此,在肽聚糖提取過程中應充分考慮肽聚糖類型所帶來的差異,選用最合適的蛋白酶進行處理,或直接選用復合酶處理。

確定TCA-SDS-復合酶處理工藝后,本研究利用該方法提取制備了3種不同類型的肽聚糖,并分別分析了它們對TTX含量和毒性的消減效果。如圖7所示,肽聚糖主要是由糖鏈和肽尾組成的,部分肽聚糖還會出現肽橋,且不同類型肽聚糖的差異主要體現在肽尾和肽橋的部分;A4α肽聚糖單體的肽橋上有1個天冬氨酸,使該類肽聚糖含有較多的游離氨基[23];而另外兩種肽聚糖中,A3α肽聚糖的肽橋上含有5個相連的甘氨酸,無游離活性基團[24];A1γ肽聚糖則沒有肽橋[25]。本研究顯示不同類型的肽聚糖對TTX的消減效果都較好,但其中I3菌株的A4α型肽聚糖對TTX的含量和毒性均有著最高的消減率(85.06%和93.02%)。因此,推測肽聚糖對TTX的消減效果很可能與其含有的游離基團有關,A4α肽聚糖相比另外兩種肽聚糖擁有更多的游離活性氨基,這可能是其對TTX消減效果最好的原因所在?，F有研究已經探明TTX是一種兩性內鹽,其活性基團為胍基和羥基,兩者在溶液中分別帶正電和負電[11]。3種肽聚糖的肽尾末端丙氨酸(D-Ala)含有帶負電的游離羧基、糖鏈上含有大量的帶負電羥基,以及A4α肽聚糖上天冬氨酸含有的帶正電氨基,這些基團可能通過靜電作用等方式促進肽聚糖與TTX的相互結合,從而使肽聚糖對TTX產生消減作用,目前肽聚糖與TTX的相互作用方式及其作用位點尚不清晰,有待今后深入研究。

圖7 三種肽聚糖的單體分子結構圖Fig.7 Molecular structure diagram of three types of peptidoglycan monomers

綜上,本研究通過對肽聚糖提取過程中去除磷壁酸、脂質和蛋白質的工藝優化,選擇低毒性的TCA作為去除磷壁酸的試劑,引入胰蛋白酶和鏈霉蛋白酶的復合酶系統去除肽聚糖上的共價結合蛋白質,并確保整個提取過程的安全性,建立的提取純化方法可以獲得高純度、結構完整和高活性肽聚糖,并且適用于多種類型的肽聚糖。此外,研究發現制備的3種乳酸菌肽聚糖對TTX的消減效果非常顯著,其含量去除率>78%,毒性消減率>87%。本研究為未來肽聚糖的產業化制備及其對TTX的毒素消減作用機制研究提供了方法支撐和科學依據。