橄欖仁抗氧化肽的分離鑒定及分子對接

張迎陽,董亞云,鄒平,鄭文武

(常州大學 藥學院/生物與食品工程學院,江蘇 常州,213164)

我國是世界栽培橄欖最多的國家,主要分布在福建、廣東(多屬烏欖),橄欖營養豐富,含有17種人體所需要的氨基酸,尤其含鈣質和維生素C十分豐富,對孕婦及兒童大有補益[1]。

植物多肽是從植物中分離得到的具有促進免疫、抗氧化、抗菌等生理功能的生物活性肽[3],其來源廣泛、獲取成本低、營養價值高。當前已有許多植物源抗氧化肽的報道,如桑葉蛋白[3]、猴頭菇[4]、紫花蕓豆蛋白[5]等。經過蛋白酶水解可將高分子的蛋白質轉化為短鏈的多肽甚至是氨基酸,這些低分子質量的多肽生物活性比原蛋白更高。蛋白質來源、蛋白酶類型,水解條件等因素影響蛋白水解產物的抗氧化活性,因此選擇合適的條件水解蛋白具有重要的意義[6]。

本文以橄欖仁為原料,采用酶解法制備抗氧化肽。首先從6種商用蛋白酶中以水解度(degree of hydrolysis,DH)、DPPH自由基清除率為考察指標篩選蛋白酶,利用單因素試驗和響應面分析法優化酶解條件,制備橄欖仁抗氧化肽。對最優工藝條件下制得的酶解液進行分離鑒定,得出抗氧化活性較強的肽段,并通過分子對接技術對橄欖仁抗氧化肽與超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)進行對接模擬,對其生物學性質進行評價并確定其分子機制,為進一步對植物抗氧化活性肽的研究和開發應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橄欖仁,福建;ABTS、DPPH、1,10-菲咯啉,Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司;CuSO4、無水乙醇、牛血清蛋白、NaOH、鄰二氮菲、FeSO4,上海凌峰化學試劑有限公司;石油醚、酒石酸鉀鈉、國藥集團化學試劑有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、三氯乙酸,谷胱甘肽(glutathione, GSH),上海阿拉丁試劑有限公司。所有其他化學品和試劑均為分析級。

UV1200B紫外可見分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司;TG16G多功能離心機,Eppendorf/艾本德;XL-130粉碎機,上海精宏實驗設備有限公司;ATY224精密電子天平,奧豪斯儀器(上海)有限公司;RE-2000B旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器公司;SCIENTZ-50真空冷凍干燥機,寧波新芝凍干設備股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 橄欖仁成分分析

水分測定參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》;脂肪含量參照GB/T 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》;灰分含量參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》;蛋白含量參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》;氨基酸分析參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》。

1.2.2 脫脂粉制備

將橄欖仁去皮粉碎后過40目篩,按料液比1∶4(g∶mL)加入石油醚。磁力攪拌5 h進行脫脂,進行抽濾至濾液澄清后置于通風櫥中,將溶劑揮發。再次粉碎后過40目篩,得橄欖仁脫脂粉,置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.3 多肽提取

提取方法參考文獻[7]。橄欖仁脫脂粉按料液比1∶40(g∶mL)加入去離子水配制成溶液,攪拌均勻后離心(4 ℃、4 000 r/min、20 min)收集上清液,調節pH值為4.0,攪拌30 min后離心收集沉淀。水洗中和后冷凍干燥得到橄欖仁蛋白。將橄欖仁蛋白按液料比加入去離子水穩定后加入蛋白酶進行酶解反應。酶解結束后沸水浴20 min滅酶。冷卻至室溫后離心(4 ℃、4 000 r/min、20 min)收集上清液后得到橄欖仁多肽,冷凍干燥后置于4 ℃備用。

1.2.4 蛋白酶的篩選

如表1所示選用6種酶,在各自最適pH和溫度下酶解橄欖仁蛋白,選取DPPH自由基清除率和DH為測試指標,篩選出最適宜的蛋白酶。

表1 蛋白酶的特異性和作用條件Table 1 Specificity and operation conditions of different proteases

1.2.5 單因素試驗

研究底物濃度、酶底比、酶解時間、酶解溫度對橄欖仁粗肽液DPPH自由基清除率的影響。設計各單因素條件為:底物質量濃度20、30、40、50、60 g/L;酶底比1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%(質量分數,下同);酶解時間60、90、120、150、180、240 min;酶解溫度45、50、55、60、65、70 ℃,進行橄欖仁粗肽的提取,測定粗肽液DH以及對DPPH自由基的清除率。

1.2.6 響應面法優化提取工藝

以單因素試驗結果為基礎,使用Design Expert 8.0.6軟件根據Box-Behnken中心組合設計原理,以DPPH自由基清除率為指標,通過響應面分析對提取條件進行優化,得到酶解法制備抗氧化肽的最優條件,試驗因素水平如表2所示。

表2 響應面分析實驗因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface design

1.2.7 DH測定

參考GB 5009.235—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定》測定橄欖仁多肽液中氨基酸態氮含量,總氮含量測定參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》。DH的計算如公式(1)所示:

(1)

1.2.8 DPPH自由基清除率測定

參照文獻[18]稍作修改。在試管中加入2 mL多肽溶液和2 mL 0.4 mg/mL DPPH溶液,作為實驗組(A1),混勻后室溫下避光反應30 min,于517 nm下測定其吸光度值。以無水乙醇代替DPPH溶液作對照組(A2),以水代替多肽液作空白組(A3)。每組實驗重復3次取平均值,DPPH自由基清除率的計算如公式(2)所示:

(2)

1.2.9 超氧陰離子自由基(·O2-)清除率測定

測定方法參照文獻[9]。配制1 mg/mL的橄欖仁多肽液,取1.5 mL多肽液依次加入0.5 mL 300 μmol/L氯化硝基四氮唑藍(pH 8.0 Tris-HCl緩沖液配制),0.5 mL 468 μmol/L還原型輔酶Ⅰ(pH 8.0 Tris-HCl緩沖液配制),0.5 mL 60 μmol/L吩嗪硫酸甲酯(pH 8.0 Tris-HCl緩沖液配制),振蕩混勻,25 ℃水浴5 min,560 nm波長測定吸光值,記為A2。以緩沖液代替樣品作為空白對照,測定吸光度值記為A1?！2-清除率的計算如公式(3)所示:

(3)

1.2.10 羥自由基(·OH)清除率測定

測定方法參照文獻[10]。在試管中加入4 mL 5 mmol/L 1,10-鄰菲咯啉溶液和4 mL 5 mmol/L FeSO4溶液,然后加入3 mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)、H2O20.3 mmol/L和4 mL多肽溶液,于36 ℃下反應1 h,在536 nm處測量吸光度記為A1。用蒸餾水代替多肽溶液,其他試劑與樣品相同,測定吸光度記為A2。用蒸餾水代替H2O2,其他試劑與樣品相同,測定吸光度記為A3?！H清除率的計算如公式(4)所示:

(4)

1.2.11 橄欖仁抗氧化肽分離鑒定

根據優化后的酶解工藝條件提取橄欖仁多肽,進行分離純化,選擇SephadexG-25和SephadexG-15分別進行2次分離純化[11]。SephadexG-25分離純化條件:選擇26 mm×1 m層析柱,蒸餾水經45 nm過濾后作為洗脫液進行洗脫,調節流速0.5 mL/min,每管收集5 mL洗脫液,分別進行抗氧化性能測試,選擇抗氧化性能好的收集液進行SephadexG-15二次分離純化并進行抗氧化性能測試,條件同SephadexG-25。

nano-HPLC-MS/MS分析:將樣品經由配備在線納噴離子源的LC-MS/MS分析。整套系統為串聯EASY-nanoLC 1200的Q ExactiveTMPlus質譜儀(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)。共上樣5 μL樣品(分析柱Acclaim PepMap C18, 75 μm×25 cm),以60 min的梯度分離樣品,柱流量控制在300 nL/min,柱溫40 ℃,電噴霧電壓2 kV。質譜儀在數據依賴采集模式下運行,自動在MS和MS/MS采集間切換。質譜參數設置如下:(1)MS:掃描范圍m/z為200～1 800;分辨率70 000;AGC target為3e6;最大注入時間為50 ms;(2)HCD-MS/MS:分辨率為17 500;AGCtarget為1e5;最大注入時間為45 ms;碰撞能量為28;動態排除時間為30 s。

1.2.12 分子對接

從PDB數據庫下載SOD(PDB ID:2ADQ)蛋白結構;使用Pymol 2.3.0去除蛋白結晶水、原始配體等,將蛋白結構導入Auto Docktools(v1.5.6)進行加氫、計算電荷、分配電荷、指定原子類型并保存為“pdbqt”格式[12]。使用POCASA 1.1預測蛋白結合位點,采用AutoDock Vina1.1.2進行對接,CASP3相關參數設置為:center_x=-5.9,center_y=28.9,center_z=210.4;搜索空間:size_x:80,size_y:80,size_z:80(每個格點的間距為0.375?),exhaustiveness:10,其余參數為默認設置。

1.4 數據分析

試驗中每組試驗重復3次,使用Origin 2022b對數據進行繪圖,分子對接部分采用ChemBioDraw Ultra 14.0繪制多肽的結構,利用PyMOL2.3.0和LigPlot+ v 2.2.5進行對接結果的相互作用模式分析。

2 結果與分析

2.1 橄欖仁成分分析

橄欖仁的基本成分見表3,橄欖仁中有較高的營養成分,油脂和蛋白質含量之和高達77.51%,水分和灰分含量均不高。橄欖仁蛋白氨基酸組分如表4所示,橄欖仁中必需氨基酸總量占全部氨基酸含量的34.01%。其中精氨酸含量最高為81.501 mg/g,谷氨酸含量僅次于精氨酸,這2種氨基酸在食品工業中廣泛應用。

表3 橄欖仁的基本成分Table 3 Compositions of olive kernel

表4 橄欖仁的氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of olive kernel

2.2 蛋白酶的選擇

酶可以將蛋白質水解成小分子物質,DH是衡量酶解效果重要指標之一[13],蛋白酶具有專一性,具有特異性酶切位點,不同的酶對橄欖仁蛋白水解得到的酶解產物具有不同的生物活性[19]。由圖1可知,6種蛋白酶對產物DH影響差異較大,木瓜蛋白酶處理組DH高達27.73%,明顯高于其他組。同樣,酶解產物的抗氧化活性差異明顯,木瓜蛋白酶酶解所得多肽的DPPH自由基清除率最高,為71.46%,其次是堿性蛋白酶和胃蛋白酶,清除效果最差的為胰蛋白酶,為21.81%。橄欖仁氨基酸組成中,Phe和Lys這2種氨基酸含量較高,與木瓜蛋白酶的酶切位點正好相同[14]。酶解反應受多種條件的影響,不同酶的反應條件各不相同,將蛋白酶組合進行酶解雖可以少量提升多肽得率,但其對于反應條件的控制也更為苛刻,容易引起蛋白質失活[15],所以綜合考慮選擇木瓜蛋白酶作為橄欖仁蛋白的水解酶。

圖1 不同蛋白酶處理組的DH及DPPH自由基清除率Fig.1 DH and DPPH free radical clearance ability in different protease-treated groups

2.3 單因素試驗結果

由圖2-a可知,底物質量濃度由20 g/L增加到50 g/L時DH不斷上升達到最大,底物濃度>50 g/L時,DH開始下降。這是因為底物濃度過高,蛋白質與水分子接觸不充分,不利于酶和底物的反應,從而導致DH降低[16]。DPPH自由基的清除率隨著底物濃度增大而增大,底物質量濃度為40～60 g/L時清除率差別不大。綜合考慮,酶解選擇最佳底物質量濃度為50 g/L。由圖2-b所示,由于蛋白質的量有限,當酶底比為3.0%(質量分數,下同)后DH提高不明顯,體系達到飽和狀態,DPPH自由基清除率在酶底比為2.5%達到最大值[17]。酶底比增加清除率有降低的趨勢,從節約成本考慮,選擇酶底比為3%比較適宜。由圖2-c可知,反應90 min后,反應速率降低,過長的時間會導致了部分長肽也被水解[18]。DPPH自由基的清除率在120 min時達到最大,隨著水解時間的增加,橄欖仁蛋白水解物的活性沒有明顯增加。綜合考慮,最佳酶解時間為90 min。由2-d所示,酶解溫度在65 ℃時,DH達到最高隨后DH降低,木瓜蛋白酶的適用溫度區間較大,但溫度過高會降低蛋白酶活力。DPPH自由基的清除率在45 ℃時較低,當溫度在50～70 ℃時,清除率變化不明顯。綜合考慮,選擇60 ℃為最佳酶解溫度。

2.4 響應面試驗結果

選取酶底比(A)、溫度(B)、時間(C)3個因素,以DPPH自由基清除率為響應值,進行響應面優化試驗,分析酶解橄欖仁制備抗氧化活性肽的最佳工藝條件。試驗設計結果見表5。

表5 響應面設計方案與試驗結果Table 5 Response surface design scheme and test results

運用Design-Expert.V8.0.6軟件,通過擬合,進行二次回歸分析,得到DPPH自由基清除率的回歸方程,如公式(5)所示:

Y=70.64+5.52A+1.37B-0.23C+2.19AB+0.23AC-2.07BC-5.63A2-6.43B2-5.17C2

(5)

響應面方差分析結果如表6所示,P<0.000 1,該模型達到了極顯著水平,且擬合方程的R2=0.986 1,表明二次回歸模型具有良好的擬合度。酶底比的影響顯著,其次是溫度,最后是時間。

表6 試驗結果響應面二次模型方差分析表Table 6 Analysis of variance table of quadratic model of response surface of experimental results

模型中的酶底比、溫度、時間的一個因素固定在0水平,得到了其他2個因素與DPPH自由基清除能力相互作用的子模型,圖3所示為三維曲面圖和等高線示意圖。

由圖可以看出,當固定C=0時,Y的較高值落在A=2.93%～3.5%、B=58～64 ℃的范圍內;當固定B=0時,Y的較高值落在A=3.0%～3.4%、C=70～110 min;當固定A=0時,Y的較高值落在B=58.50～62.05 ℃、C=80～100 min范圍內。根據軟件分析得出,最佳酶解條件為:酶底比3.26%、溫度61 ℃、時間88.48 min,此時DPPH自由基清除率預測值為72.25%。檢驗模型結果,酶底比3.3%、溫度61 ℃、時間88 min,此時測的清除率為(69.53±1.34)%,與預測值較為接近。

2.5 橄欖仁抗氧化肽分離鑒定

2.5.1 多肽分子質量的分布

利用高效液相色譜測定橄欖仁多肽的分子質量分布情況,表7為最佳酶解工藝條件下制得的橄欖仁多肽液分子質量分布情況。由面積占比可知,橄欖仁多肽相對分子質量<1 000 Da的多肽占76.04%,<3 000 Da的組分占91.56%,這一組分肽段對酶解液的營養價值和生物活性起重要作用[19]。

2.5.2 橄欖仁抗氧化肽分離鑒定

凝膠過濾色譜法是一種簡便而有效的液相柱層色譜技術[20],該法分離條件溫和、產品回收率高、工作范圍廣、分離分子質量的覆蓋面大,可分離百至數萬分子質量的分子[21]。按最佳酶解工藝制得橄欖仁多肽經由SephadexG-25分離得到5個組分。由表8可知,各組分性能差異較大,組分B抗氧化性能最好。

表8 SephadexG-25分離組分抗氧化活性Table 8 Antioxidant activities of SephadexG-25 isolated fractions

使用SephadexG-15將組分B進行二次分離,得到6個組分,如圖4所示,由質譜結合軟件分析及蛋白質數據庫分析氨基酸序列,得到氨基酸序列分別為:WLSF、TSVLR、LVYLVR、AGGKPFQ、YYPFKGFA、AFNVDERLAR。

a-WLSF;b-TSVLR;c-LVYLVR;d-AGGKPFQ;e-YYPFKGFA;f-AFNVDERLAR

如圖5所示,多肽質量濃度1 mg/mL時6種肽對DPPH自由基和·O2-的清除能力無顯著性差異,對DPPH自由基清除率最高的是TSVLR,清除率為81.07%,最低是AGGKPFQ,清除率為71.70%;對·O2-清除率均在90%以上;TSVLR肽對·OH清除率最高,達42.48%,綜合來看TSVLR肽的抗氧化能力較好。研究表明含有下列氨基酸的肽段有抗氧劑能力:組氨酸、色氨酸、賴氨酸、精氨酸、亮氨酸和纈氨酸等[22]?；钚暂^高的TSVLR肽中含有纈氨酸、亮氨酸和精氨酸,這可能對抗氧化活性有較大貢獻[23]。

圖5 SephadexG-15分離各組分抗氧化測試Fig.5 Antioxidant test of SephadexG-15 secondary separation

2.6 分子對接

SOD是存在于動物、植物及微生物中與清除活性氧密切相關的金屬蛋白酶,在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關重要的作用。SOD能有效清除體內破壞健康、導致疾病的自由基,將其分解成對人體無害的氧分子和水分子,并順利排除體外[24]。為清除細胞有氧代謝產生的各種活性氧,幾乎所有需氧生物都進化出了一套氧化防御體系來保護細胞免受不良環境的影響,SOD被認為是抗氧化系統的第一道防線,在保護細胞免受氧自由基的毒害中發揮著重要作用[25]。因此,本文選擇SOD(PDB ID:2ADQ)為受體蛋白與6種橄欖仁抗氧化肽進行對接模擬,其對接結合能、氫鍵及對接相互作用可視化圖分別見表9和圖6。結果表明,純化后的多肽能很好地與目的蛋白的活性部位結合,其結合能分別為-5.6、-6.5、-6.1、-6.4、-6.7和-5.6 kcal/mol。

表9 抗氧化肽與2ADQ的對接結合能Table 9 Docking binding energy of antioxidant peptide and 2ADQ

各肽段與SOD發生相互作用,主要是通過形成氫鍵以及疏水作用力。圖6-a表示WLSF與SOD的His163、His30形成氫鍵,氫鍵的長度分別為2.95、3.11 ?;Leu167、Tyr166、Glu162、Trp161、Tyr34、Ala33、Phe66具有疏水作用;圖6-b表示TSVLR與SOD的His30、Tyr34、His163形成氫鍵,氫鍵的長度分別為3.07、3.12、3.39、2.82、3.44、3.48 ?;與Glu162、Tyr166、Leu167、Leu25、Ser121、Trp161具有疏水作用;圖6-c表示LVYLVR與SOD的Gln46、Glu42形成氫鍵,氫鍵的長度分別為3.44、3.32 ?;與Lys65、Gln61、Pro145、Gly148、Gly68、Ile72、Leu38、Leu64、Tyr45具有疏水作用;圖6-d表示AGGKPFQ與SOD的Asn188、Arg192、Ser75、His2形成氫鍵,氫鍵的長度分別為2.83、3.06、3.38、2.87、3.00、3.27、3.06 ?;與Ile76、Lys65、Gly68、Ile72、Pro5、Thr79、Trp78、Pro8具有疏水作用;圖6-e表示YYPFKGFA與SOD的Gly148、Gln147、Asp6、Asn185形成氫鍵,氫鍵的長度分別為3.30、3.16、3.33、3.30、3.10 ?;Pro8、Thr79、Pro5、Ser75、Ile76、Ser75、Ile76、His71、Ile72具有疏水作用;圖6-f表示AFNVDERLAR與SOD的Pro62、Tyr34、Glu62、His163、His30形成氫鍵,氫鍵的長度分別為3.38、3.16、3.13、2.87、3.14、2.77、3.43、3.05 ?;與Tyr166、Leu167、Phe66、Ser121、Trp161具有疏水作用[25]。

a-SOD-WLSF;b-SOD-TSVLR;c-SOD-LVYLVR;d-SOD-AGGKPFQ;e-SOD-YYPFKGFA;f- SOD-AFNVDERLAR

在本研究中,進行了6種橄欖仁抗氧化肽與SOD蛋白之間的分子對接研究,以研究其作用機制。結果表明,純化肽和抗氧化相關靶蛋白之間的疏水效應和氫鍵可能是其潛在生物活性的原因。通過對6種抗氧化肽與SOD蛋白之間的分子對接研究,分析其對接結果,發現YYPFKGFA、TSVLR與SOD具有較高的結合能,同時YYPFKGFA、TSVLR也可以與SOD結合產生氫鍵,因此我們猜測YYPFKGFA與TSVLR可以提高SOD的酶活性,但因為蛋白質在生物體內的反應受很多條件影響,不同的溫度、酸堿度等都會導致SOD失活[26],因此想要探究YYPFKGFA、TSVLR對于SOD的影響還需要進一步實驗論證。

3 結論

本研究采用響應面優化酶解工藝、分級、超濾、色譜分析以及抗氧化活性測定等方法,從橄欖仁水解物中提取分離并鑒定了具有抗氧化活性的肽。6種蛋白酶水解物經過抗氧化活性測試得出木瓜蛋白酶較適合制備橄欖仁抗氧化活性肽,響應面優化出的最佳提取工藝為底物質量濃度50 g/L、酶底比為3.3%(質量分數)、溫度61 ℃、時間88 min。將所得粗肽經過SephadexG-25和SephadexG-15兩次分離純化后發現6個肽具有良好的抗氧化活性。分別為WLSF、TSVLR、LVYLVR、AGGKPFQ、YYPFKGFA、AFNVDERLAR。多肽質量濃度為1 mg/mL時,綜合對比出TSVLR肽的抗氧化能力較好,對DPPH自由基清除率為81.07%,對·O2-的清除率在90%以上。分子對接研究表明,純化肽和SOD之間的疏水效應和氫鍵可能是橄欖仁活性肽具有良好的抗氧化活性的原因。本研究結果表明橄欖仁具有較好的抗氧化活性,可作為天然食物來源制取功能性食品的一個新的探究方向,并且由于其有益作用,在經濟上可能具有更好的前景。