膜醭畢赤酵母蛋白復合膜對桃采后果腐病的抑制效果及機制

陳海藝,徐悅,劉藝璇,張亞敏,郭紅蓮

(天津科技大學 食品科學與工程學院,天津,300457)

桃作為典型的呼吸躍變型果實,采后因后熟而軟化,使其在貯運中極易受致病菌侵害[1]。鐮刀孢(Fusariumspp.)是桃果實采后主要致病菌之一,侵染后導致果實腐爛,最終失去其商品價值[2]。因此,亟需探尋一種綠色安全的防腐保鮮手段以延長桃果實貨架期。

近年來,天然抑菌膜成為果蔬防腐保鮮中的研究熱點。天然抑菌膜是將天然抑菌劑如動物、植物源提取物、微生物代謝產物等復配成膜基材制成的具有抗菌活性的薄膜,通常以直接包裹或噴涂形式來防控致病菌侵染,以延長果蔬采后貯藏期[3]。方靜等[4]制備的肉桂精油-殼聚糖復合膜可顯著降低芒果采后炭疽病的發生;WANG等[5]制備的納他霉素-瓊脂復合膜對黑曲霉表現抑制活性,維持了新鮮草莓的采后品質。膜醭畢赤酵母抑菌蛋白是本實驗室從膜醭畢赤酵母發酵液中提取的一種具有抑菌活性的蛋白類物質,已有研究表明對灰葡萄孢[6]和交鏈孢[7]表現出較強的抑菌活性,可作為抑菌膜中天然抑菌劑的來源。實驗室前期已制備出一種膜醭畢赤酵母蛋白復合膜[8],但并未對該復合膜在果蔬采后病害中的應用效果進行深入研究,且作用機理尚未明確。

因此在此基礎上,本文首次探索膜醭畢赤酵母蛋白復合膜對鐮刀孢的體外抑制機制及對桃果采后果腐病防治效果,為該膜在果蔬采后病害防治及防腐保鮮提供可靠方法和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

鐮刀孢(Fusariumspp.)、膜醭畢赤酵母菌(Pichiamembranaefaciens)由天津科技大學農產品物流保鮮與加工室提供;草酸、2,6-二氯靛酚鈉、抗壞血酸、戊二醛,天津市盛鑫源偉業貿易有限公司;玉米淀粉、卡拉膠(食品級)、甘油,河南萬邦化工科技有限公司;實驗用桃果購買于天津市塘沽區水果市場。

1.2 儀器設備

ZHJH-C1109B無菌操作臺,上海智城分析儀器制造有限公司;N50 TOUCH超微量紫外分光光度計,德國Implen公司;TU-1810紫外分光光度計,北京普析通用儀器有限公司;SU1510掃描電子顯微鏡,日本HITACHI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 膜醭畢赤酵母抑菌蛋白的提取

冷水浴下,將(NH4)2SO4緩慢加入膜醭畢赤酵母發酵液中至(NH4)2SO4最終飽和度為60%。冷藏過夜后離心,收集沉淀物,透析除鹽后冷凍干燥得到粗蛋白質提取物粉末。

1.3.2 膜醭畢赤酵母蛋白復合膜的制備

據本實驗前期研究,以質量分數6%玉米淀粉、4 g/L卡拉膠溶液等體積混合后添加體積分數1%的甘油制備基礎膜液,再加入體積分數1%的抑菌蛋白溶液得到終質量濃度為2.5 mg/mL的蛋白復合膜液[8],并以涂膜方式應用于桃果采后防腐研究。

1.3.3 鐮刀孢孢子懸液制備

將病原菌接種于PDA培養基中25 ℃培養7 d,無菌水清洗孢子后6層紗布過濾,制成1×106spores/mL孢子懸浮液,備用。

1.3.4 蛋白復合膜體外抑菌活性測定

將30 μL蛋白膜液均勻涂至PDA平皿,待膜液完全滲入培養基后接入鐮刀孢菌餅,于27 ℃恒溫培養箱中培養,每隔24 h測量菌落直徑,以無菌水作為空白對照。按公式(1)計算抑制率:

菌絲生長抑制率/%

(1)

參照文獻[9]測定膜液對孢子萌發的抑制效果。按公式(2)計算抑制率:

(2)

1.3.5 菌絲掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察

分別挑取正常和受抑制的病原菌菌絲,經磷酸鹽緩沖溶液沖洗懸浮后離心,棄去上清液收集沉淀。參照代博仁等[10]的方法制備SEM樣品,噴金后觀察菌絲形態變化。

1.3.6 蛋白復合膜對鐮刀孢細胞膜通透性影響

參照PEREIRA等[11]的方法,用超微量紫外分光光度計測定兩組菌體上清液在OD260、OD280下核酸和蛋白質含量。

1.3.7 蛋白復合膜對桃果采后果腐病的防治效果

果實預處理[12]后,用無菌打孔器在其赤道處等距離打3孔(深3 mm,直徑3 mm),每孔接注30 μL 蛋白膜液,以等量無菌水作空白對照。自然晾干后,每孔注入30 μL 致病菌孢子懸液,于20 ℃、相對濕度95%條件下貯藏。定期記錄桃果實發病情況。

1.3.8 蛋白復合膜對桃果實品質的影響

1.3.8.1 硬度測定

采用GY-4型硬度計測定貯藏期內每顆果實赤道處正反兩側硬度,記錄各組果實硬度變化。

1.3.8.2 褐變度測定

參照LIU等[13]的方法,桃果肉經體積分數為95%乙醇溶液研磨成勻漿后于10 000 r/min下離心10 min,收集上清液于420 nm下測定吸光度,以A420nm表示果實褐變程度。

1.3.8.3 可溶性固形物含量測定

采用手持型阿貝折光儀測定桃果實可溶性固形物含量變化,結果以百分比計。

1.3.8.4 維生素C含量測定

采用2,6-二氯靛酚滴定法[14]測定果實中維生素C含量。

1.4 數據統計與分析

數據采用Excel 2010軟件處理,實驗設置3個平行,結果以平均值±標準差表示。運用SPSS 20.0進行數據統計分析,Duncan檢驗進行顯著性分析,檢驗水平P<0.05,并用Origin 2018 作圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白復合膜對鐮刀孢的體外抑菌活性

如圖1-a所示,膜液處理組菌落直徑始終小于CK組,第2天與CK組開始表現差異(P<0.05)。此后隨著培養時間逐漸擴大,第6天實驗組菌落直徑僅(40±2) mm,且在處理3 d時有最大抑菌率56.72% (圖1-b)。抑菌物質的體外抑菌活性還表現為對致病菌孢子萌發的影響,處理8 h 的孢子萌發情況見表1。CK組孢子幾乎全部萌發且芽管細長,蛋白膜液處理后的孢子萌發率僅(32.67±4.04)%,且已萌發的孢子芽管短小,萌發率差異顯著(P<0.05)。

a-蛋白膜液處理下鐮刀孢菌落形態;b-菌絲生長抑制率

表1 蛋白膜液對鐮刀孢孢子萌發影響Table 1 Effect of protein film liquid on the germination of Fusarium spp.spores

2.2 蛋白復合膜處理后鐮刀孢菌絲的SEM觀察

正常和受抑制的菌絲表面特征見圖2。正常生長的菌絲粗壯、飽滿,表面平滑規整且分支較少(圖2-a)。而蛋白膜液處理后的菌絲體粗細不均,分支增多,頂端和中部不規則膨大(圖2-b、圖2-c);此外菌絲表面多皺褶、少量內容物滲出,出現斷裂現象(圖2-d)。此前VIRGH等[15]研究發現,抗菌蛋白NFAP能夠改變構巢曲霉菌絲形態,造成菌絲頂端膨大、扭曲畸變來抑制其生長,與本文研究具有相似性。說明蛋白膜液可通過破壞鐮刀孢菌絲細胞膜的完整性,使胞內大分子物質流出,從而抑制其生長。

a-CK;b、c、d-蛋白膜液

2.3 蛋白復合膜對鐮刀孢菌絲細胞膜通透性的影響

核酸和蛋白質作為胞內重要的大分子物質,其含量變化是評價菌體細胞膜完整程度的重要標尺[16]。如圖3所示,膜液處理后,鐮刀孢核酸(圖3-a)和蛋白質(圖3-b)外滲量均呈增長趨勢,顯著高于CK組(P<0.05)。4 h內菌體核酸及蛋白質含量迅速升高,可能是菌體在突然遭受逆境時未能及時做出應激反應,膜結構遭到破壞,使得胞內穩態失衡,物質大量外滲。隨著處理時間延長,增長趨勢逐漸平緩,推測此階段多數菌體已被破壞完全,胞內蛋白、核酸物質被全部釋放。以上結果進一步驗證了蛋白膜液破壞了鐮刀孢膜結構的完整性。

a-核酸含量;b-蛋白質含量

2.4 蛋白復合膜對桃果采后果腐的防治效果

蛋白復合膜對桃果腐病防治效果如圖4-a所示,CK組桃果接種鐮刀孢后第2天已開始發病,4 d時果實病斑直徑顯著擴大且布滿白色菌絲,發病率高達61.67%;而實驗組桃果直到第6天才可觀察到明顯的褐色病斑,發病率僅為43.33%,與CK組差異顯著(P<0.05)。當貯藏至第8天,CK組果實已大面積腐爛,實驗組桃果僅出現(19.33±1.53)mm的褐斑,病斑擴展抑制效果最高可達72.09%(圖4-b)。表明蛋白復合膜能夠降低桃果的腐爛程度,對桃果采后果腐病的發生具有良好的防治效果。

a-蛋白復合膜對桃果損傷接種后發病影響; b-蛋白復合膜對桃果損傷接種后病斑直徑影響

2.5 蛋白復合膜對桃果實品質的影響

2.5.1 對桃果硬度影響

硬度是決定果蔬采后貯藏性及抗病性的重要因素[17]。兩組桃果實硬度均與貯藏時間呈負相關(圖5-a),而復合膜處理組硬度下降速度緩慢,且果實硬度始終高于CK組;貯藏至第8天,CK組桃果實硬度為(4.9±0.3) kg/cm2,而復合膜處理下桃果實的平均硬度(7.93±0.31) kg/cm2是CK組的1.6倍,二者差異顯著(P<0.05)。蛋白復合膜處理能顯著提高果實硬度,推測該膜可抑制鐮刀孢在果實傷口表面繁殖,防止果實細胞壁被破壞。

2.5.2 對桃果褐變度影響

桃果實隨貯藏時間逐漸褐變,CK組桃果實褐變進程較快,貯藏 2 d后開始迅速褐變,而復合膜處理下的桃果實呈緩慢褐變趨勢,褐變程度遠低于CK組(圖5-b)。貯藏末期,復合膜處理下的果實褐變度比CK組降低了39.15%,與CK組表現顯著差異(P<0.05),推測復合膜具有良好的隔氧性能使得果體中多酚氧化酶的活性降低[18],從而抑制果實內多酚類物質的氧化,延緩桃果實褐變。

2.5.3 對桃果實可溶性固形物含量影響

可溶性固形物(total soluble solids,TSS)是果實內在品質的表現,影響果實風味。如圖6-c所示,兩組果實TSS含量均呈下降趨勢,這可能是果實中糖類物質作為呼吸底物被消耗造成的結果[19]。貯藏末期,蛋白復合膜處理后果實TSS含量相對CK組提高了9.27%。但整個貯藏期內,實驗組TSS含量始終高于CK組并維持在較高水平,這可能是膜處理后桃果實呼吸產生的CO2積累在膜內,使得桃果呼吸強度減弱而抑制TSS作為底物被消耗,以維持果實較好的生理品質。

2.5.4 對桃果實維生素C含量影響

維生素C是評判果實衰老和營養價值的重要指標。成熟桃果實體內不再合成維生素C反而隨時間逐漸被氧化分解,使兩組維生素C含量在貯藏期內均呈下降趨勢(圖5-d)。第2天,CK組維生素C含量迅速下降,而膜處理組下降延遲至第4天;第8天膜處理組果實維生素C含量[(1.73±0.35) mg/100 g]是CK組[(0.5±0.1) mg/100 g]的3.46倍,二者差異顯著(P<0.05)。推測是蛋白復合膜通過減弱桃果呼吸強度降低了體內氧化酶活性[20],減弱桃果代謝活動,從而延緩維生素C被氧化,與上述維持其TSS含量的機制具有一致性。

a-硬度;b-褐變程度;c-TSS含量;d-維生素C含量

3 結論

以膜醭畢赤酵母蛋白為抑菌劑制備的天然生物抗菌膜對鐮刀孢表現出較強的抑菌活性。離體實驗證實蛋白膜液可顯著抑制鐮刀孢孢子萌發,抑制率達67.33%,菌落抑制率為56.72%;掃描電鏡下觀察到鐮刀孢菌絲粗細不均,頂端或中部不規則膨大、內容物外滲現象;蛋白膜液處理后致病菌胞外蛋白質及核酸含量均上升,說明該復合膜作用機理之一在于增大鐮刀孢菌體膜透性,使得膜內物質流出,最終導致菌絲消解甚至死亡。

桃果實有傷接種實驗證實膜醭畢赤酵母蛋白復合膜能夠降低桃果實采后果腐病發病率,對病斑直徑擴展的抑制效果高達72.09%;桃果實采后生理品質的測定表明蛋白復合膜能夠維持桃果硬度并延緩褐變,延緩果實體內TSS及維生素C含量下降,有效維持了桃果采后生理品質。

膜醭畢赤酵母蛋白復合膜作為一種天然生物抗菌膜,為其在果蔬采后防腐保鮮提供了參考。