微生物合成乳酸的細胞工廠構建研究進展

王曉娜,田開仁,吳昊,寇佳祥,喬建軍,,李艷妮*

1(天津大學 化工學院,天津,300072)2(系統生物工程教育部重點實驗室,天津,300072) 3(天津大學 浙江研究院(紹興),浙江 紹興,312300)

自1780年瑞典化學家舍勒從酸奶中分離得到乳酸以來,乳酸作為一種酸味劑、增味劑和防腐劑,在食品、制藥、化妝品和其他化學工業中占據了重要地位。近年來,乳酸作為生產聚乳酸的原料而備受關注。聚乳酸作為一種可生物降解的聚合物,可替代石油基塑料用于包裝和醫療領域。此外,光學純L-乳酸或/和D-乳酸聚合成的聚乳酸具有更好的熱穩定性和機械性,有望在未來應用于汽車和電子領域[1]。乳酸的市場需求每年以10%的速度增長,且2022年全球乳酸產能已達到99.5萬t。因此,具有高光學純度和低發酵成本等優勢的微生物發酵法生產乳酸受到廣泛關注。

為了構建具有高產量、高產率和高生產率的高效乳酸合成微生物細胞工廠,研究人員開發了多種代謝工程策略,包括乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)的表達調控、糖酵解途徑優化、副產物途徑的阻斷、氧化還原平衡調節等。與此同時,通過拓寬微生物細胞工廠中可利用的碳源種類降低乳酸發酵成本,提高菌株工業魯棒性,為放大發酵奠定了堅實的基礎。此外,在基因編輯、多基因同時調控、基因動態調控、高通量篩選等新技術的輔助下,乳酸合成微生物細胞工廠的構建得到了顯著加速。在這個過程中,不同菌種在乳酸生產方面具有不同的優勢和生產能力。表1為不同菌種高產乳酸的研究現狀總結。

表1 不同菌種的乳酸生產能力研究現狀Table 1 Research status of lactic acid production capacity of different strains

本文總結了近年來利用合成生物學和代謝工程技術構建微生物細胞工廠合成乳酸的研究進展,并對當前面臨的挑戰及未來的研究方向進行了探討。

1 代謝通路的構建與優化

要構建高產量、高產率和高生產率的乳酸合成微生物細胞工廠,乳酸代謝通路的構建與優化是不可或缺的。LDH的表達調控、糖酵解途徑的強化以及副產物代謝途徑的敲除,可為乳酸的形成提供更多代謝通量;阻斷L-乳酸或D-乳酸對映體的生成,實現了高光學純度乳酸的生產。此外,新興的基因組規模代謝網絡模型(genome-scale metabolic model, GSMM)從全局水平指導乳酸生產菌株的改造,為乳酸產量的提高提供了新的思路(圖1)。

1.1 LDH的表達調控

LDH催化丙酮酸生成乳酸是微生物合成乳酸的關鍵步驟。在天然乳酸生產菌中,可使用強啟動子取代LDH的啟動子和增加基因拷貝數來提高乳酸產量[13]。而對于非天然乳酸生產菌株或合成量較少的菌株,需篩選高酶活力的LDH來構建異源代謝通路。目前未見研究來系統評估來源不同的LDH催化活性及同一個LDH在不同的宿主存在活性差異,研究人員仍需檢測多個不同來源的LDH來挑選具有較高活性的酶,不同微生物細胞工廠使用的LDH來源如表2所示。隨著合成生物學工具和策略的發展,一些基因表達元件或方法可以用于提高LDH的表達水平和催化效率。ZHOU等[14]通過啟動子工程策略,調整ldhA上游的潛在轉錄區域來微調基因表達,實現了菌株生長速率和乳酸產量的同時提高。田康明等[15]使用溫度誘導型啟動子PR-PL作為遺傳開關來調控E.coli中乳酸的合成。前期低溫發酵以保證高細胞密度,后期高溫發酵則誘導LDH表達。與之類似,HWANG等[16]利用Pnar啟動子將E.coli發酵過程分為高氧誘導生長階段和低氧誘導乳酸合成,這兩種LDH的動態調控方法均能有效提高乳酸產量(圖1-a)。此外,REIDER APEL等[17]利用CRISPR/Cas9技術構建了一個無克隆的工具包,可以用于S.cerevisiae中LDH的整合位點和啟動子的選擇。目前單純通過LDH的表達調控尚不能達到乳酸工業化生產的要求,還需進行其他代謝工程改造。

a-LDH的表達調控;b-糖酵解途徑的強化;c-副產物途徑的敲除;d-乳酸光學純度的提升;e-GSMM指導菌株改造[12]

表2 不同宿主中異源表達LDH的來源Table 2 Source of heterologously expressed LDH in different hosts

1.2 糖酵解途徑的強化

乳酸的合成前體是丙酮酸,而丙酮酸是糖酵解的終產物。因此,為了實現高效的乳酸生產,需要加強糖酵解途徑(圖1-b)。磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)和丙酮酸激酶(pyruvatekinase,PYK)是糖酵解的限速酶[18]。在E.coliKO20中,通過pfk和異源pyk基因的過表達可使乳酸產量增加9倍[19]。在C.glutamicumCRZ2中,過表達pfk基因乳酸產量僅能提高15%,過表達pyk則會導致產量下降,而過表達負責葡萄糖轉運的葡萄糖激酶基因glk,乳酸產量提高了98%[20]。酵母中pfk和pyk基因的過表達雖能增加酶的表達,但葡萄糖的消耗率仍保持不變。因此,YAMADA等[18]通過全局代謝工程技術將不同啟動子的13種糖酵解相關基因隨機整合到酵母基因組中的δ位點,顯著提高葡萄糖消耗率,并在后續研究中將這種方法應用于乳酸高產菌株的構建[21]?？傊?強化糖酵解途徑來提升乳酸的產量的瓶頸可能并非由單一酶引起,且不同菌株中糖酵解相關基因的過表達對乳酸合成的影響也不同。因此,需要從糖酵解途徑的全局出發,系統地提高葡萄糖消耗率,進而提升乳酸的產量。

1.3 副產物途徑的敲除

乳酸發酵包括同型乳酸發酵、異型乳酸發酵以及混合酸發酵,其中同型乳酸發酵只產生乳酸,無副產物途徑,理論產率可達100%。而在異型乳酸發酵或混合酸發酵過程中,阻斷或減少副產物合成路徑能使更多的碳通量流向乳酸合成。異型乳酸發酵會產生乙醇、乙酸和CO2等副產物(圖1-c),阻斷磷酸戊糖酮解酶途徑,將碳通量重新定向到磷酸戊糖途徑,可以減少副產物的形成,提高乳酸產量。在混合酸發酵時,阻斷丙酮酸代謝旁路可提高乳酸產量(圖1-c)。在大腸桿菌中,丙酮酸甲酸裂解酶PFLB、乙酸激酶ACKA和磷酸轉乙酰酶PTA是丙酮酸代謝中影響乳酸產量的關鍵酶,對E.coliMG1655分別單基因缺失后乳酸產量可增加39.6%、25.2%和39.4%[22]。對于酵母而言,乙醇是丙酮酸代謝的主要產物。失活丙酮酸脫羧酶基因pdc和乙醇脫氫酶基因adh可減少乙醇積累,增加乳酸積累量[23],阻止二羥丙酮磷酸合成甘油可將碳通量引向乳酸合成途徑,進一步提高乳酸產量。除大腸桿菌和酵母外,不同生產菌株還需阻斷其他副產物代謝途徑,如Kluyveromycespneumoniae需在失活丙酮酸代謝關鍵基因的基礎上再失活2,3-丁二醇合成途徑[24]。

1.4 乳酸光學純度的提升

光學純L-乳酸或/和D-乳酸能夠合成高結晶度和高熔點的聚乳酸,從而用于生產纖維、薄膜和液晶,具有廣闊的應用前景[1]。因此,提高乳酸的光學純度對聚乳酸的應用至關重要。乳酸的光學純度受宿主選擇和底物復雜性的影響(圖1-d)。野生型乳酸生產菌株通常同時產生L-乳酸和D-乳酸。為了提高D-乳酸的光學純度,失活L-LDH是最常用的方法[25]。由于菌株通常含有多個L-LDH,給實際操作帶來困難,近期發表的CRISPR胞脫氨酶輔助堿基編輯器可以同時失活L.lactisNZ9000中的4個L-LDH,為乳酸菌的乳酸光學純度提升提供了新技術[26]。當存在乳酸外消旋酶基因larA時,還需敲除larA[25]。此外,甲基乙二醛旁路會同時產生L-乳酸和D-乳酸,通過失活甲基乙二醛合成酶基因mgsA,也可以提高D-乳酸光學純度[27]。最后,當過表達L-乳酸氧化酶基因loxL時,可以消耗L-乳酸,從而在被L-乳酸污染的復雜培養基中也能實現高光學純D-乳酸的發酵[28]。提高L-乳酸純度時,以上策略也適用?？傊?由于菌株的特異性和培養基的不同,通常采用多種策略聯合使用,以滿足聚合級乳酸的要求。

1.5 基因組規模代謝網絡模型指導菌株改造

基于基因組測序分析構建的GSMM,通過對微生物基因、蛋白以及代謝反應之間的關系進行表征,來預測模擬不同系統水平的代謝反應通量,為解析復雜代謝網絡和調控機制、高效定向改造微生物奠定了基礎(圖1-e)。GSMM已廣泛用于預測細胞表型、指導代謝工程、預測藥物靶點、檢測生物標志物等方面[29]。

目前,基于GSMM的代謝工程改造已經在酵母和大腸桿菌中得到了應用。2000年,報道了首個大腸桿菌GSMM—iJE660[30]。2003年,基于iJE660首次使用OptKnock算法對大腸桿菌高產乳酸的基因敲除靶點進行預測,ack、pta、pfk、fba、adhE以及glk基因的聯合缺失可得到18.13 mmol/h的最佳乳酸生產率[31]。隨著GSMM的改進和算法的更新,研究人員陸續探索了ABCMOMA、BATMOMA以及CSMMOMA等混合算法,用于預測乳酸產率的最優解。然而,以上的設計基因敲除策略需要其他基因的上調或下調以匹配所需的通量分布,因此又提出了一種基于約束的算法GeneReg[32]。經該算法預測,酵母需要至少36個基因的上調或下調,以實現酵母中乳酸的高效生產,最大乳酸合成通量為56.66 mmol/(g DW·h)。GSMM全面和系統化的代謝網絡分析,為乳酸提供了更加經濟和可持續的生產方式。隨著各種微生物GSMM的構建和完善,GSMM將用于多種乳酸菌、谷氨酸棒桿菌等微生物的代謝工程,以實現乳酸的高效生產。但目前預測精度仍不高,需要進行“濕實驗”來驗證預測,并很少獲得成功的應用。

2 氧化還原平衡的調節

細胞內的氧化還原狀態是由多個氧化還原反應組成的復雜網絡維持的。當涉及氧化還原反應的代謝途徑發生改變或引入新代謝途徑時,往往會導致細胞內的氧化還原失衡,從而降低工業微生物的生長性能和產物合成能力[33]。因此,調節氧化還原狀態是提高乳酸產量的有效途徑之一。

通過在培養基中添加甘油、山梨醇、L-半胱氨酸鹽酸鹽以及Na2S等化合物,降低底物的氧化還原電位,并提供更多的還原當量,從而顯著提高乳酸的生產率[34]。此外,NADH/NAD+和NADPH/NADP+等氧化還原輔因子在分解代謝、合成代謝以及能量產生的耦合中發揮著關鍵作用。氧化還原輔因子的擾動對產物分布以及細胞內代謝物含量均有顯著的影響。主要還原副產物(如乙醇和甘油)代謝途徑的敲低、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因gapdh的過表達[35]以及NADH脫氫酶基因nde的失活[36],均可提高胞內NADH水平,進而提高乳酸產量。此外,通過對大腸桿菌氧化還原相關反應的全基因組分析,發現D-乳酸的產量還與核苷酸和氨基酸代謝相關的脫氫酶基因(如guaB、pyrD和serA)有關。這些基因的單基因缺失可以增加乳酸產量[37]。

除氧化還原相關酶以外,全局轉錄調控因子Rex可以通過響應細胞內NADH/NAD+比率的變化來調節細胞內的氧化還原平衡[38]。失活Caldicellmlosiruptorbescii中的rex基因會使細胞內氧化還原電位降低,從而使乳酸等代謝產物積累增加[39]。但是rex基因的缺失在不同菌株中可能會產生不同的代謝效應,例如,在Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum中,rex基因的缺失解除了對adhE和adhA的表達調控,導致乙醇產量增加兩倍,而乳酸產量減少[38]。因此,rex基因的缺失的不同代謝效應可能取決于其調控的靶點不同而導致的,因此仍需進一步研究?？傊?全面了解不同菌株氧化還原代謝將有助于設計氧化還原系統以促進乳酸的高效生產。

3 底物譜的拓寬

乳酸發酵底物成本約占總成本的40%～70%,是影響乳酸生產經濟性的重要因素。為了降低乳酸的發酵成本,需要拓寬乳酸生產菌株的底物譜,促進廉價的農業工業廢棄物在乳酸發酵中的應用。

碎米、廢木薯渣以及廢姜黃等農業廢棄物中富含淀粉。然而大多數乳酸菌無法直接利用淀粉類物質,通常需要對淀粉原料進行預處理或者對菌株進行改造。研究者通過表達α-淀粉酶基因amyA,實現了利用玉米淀粉和糙米同步糖化發酵乳酸[25]。此外,木質纖維素也廣泛存在于農業廢棄物中,如玉米秸稈、大豆殘渣和甘蔗渣等。該類原料的使用可有效避免食品資源的浪費,是理想的廉價乳酸發酵底物。木質纖維素水解產物中木糖占總糖的30%,但大部分乳酸菌缺乏木糖同化的能力,使木質纖維素的應用受到限制。將來源于Lactobacilluspentosus和LactobacilluslactisIO-1的木糖同化基因引入乳酸菌后,從而使其能夠利用木糖作為碳源進行乳酸發酵[40]。對于纖維素類生物質,通常需要使用昂貴的纖維素酶進行預處理。為了解決這一問題,GANDINI等[41]在乳桿菌中整合β-葡萄糖苷酶基因bglA和內切葡聚糖酶基因engD,構建了纖維素酶系統。該菌株可利用纖維素低聚糖作為底物一步發酵生產乳酸,向光學純乳酸的低成本可持續生物發酵邁出了重要一步。

另外,廉價農業工業廢棄物的水解產物中的碳源大多是混合糖,乳酸生產菌株在混合糖存在的情況下,首先消耗葡萄糖,抑制碳分解代謝,導致糖未能充分利用,從而降低發酵效率并增加生產成本。為了解決這一問題,LU等[42]對大腸桿菌編碼葡萄糖轉運磷酸轉移酶系統的主要酶IIBCglc中的ptsG基因進行失活。ptsG基因缺失導致磷酸轉移酶(phosphotransferase system,PTS)系統被破壞,葡萄糖只能依靠半乳糖轉運蛋白GalP和Mgl等低效率的替代系統進行轉運,進而消除了分解代謝抑制。LI等[43]在阻斷PTS系統和激活Gal系統的同時,將木糖分解的限速酶木糖異構酶基因xylA替換為B.coagulans的xylABC。該雙通道工藝使木糖利用率增加46.3%。WANG等[44]通過研究基于阻遏物的木糖傳感/調控基因線路,開發了一種高通量篩選方法,成功獲得了木糖轉運蛋白HXT14的突變體,其木糖轉運能力提高了6.5倍,為提高菌株中木糖的利用率提供了新的解決方案。

以上方法雖然有助于提高底物利用率和乳酸發酵效率,但當底物復雜度增加時,這些方法的適用性會受到限制,仍需要進一步的優化和改進,以提高其在實際工業應用中的可行性和效率。

4 乳酸生產菌株的工業魯棒性

乳酸工業生產過程中面臨各種惡劣的工業條件,包括低pH值、高溫、高糖以及來自廉價生物質水解物中的有毒抑制劑等。微生物魯棒性是指面對各種擾動時保持穩定和高效表型的能力。通過理性設計加定向進化可提高菌株對惡劣工業條件和有毒抑制劑的脅迫耐受性,從而提高乳酸的產量和產率。

4.1 菌株酸脅迫耐受性的提高

微生物發酵過程中乳酸的積累導致pH值逐漸降低,當pH值低于乳酸的pKa時,游離乳酸會擴散到細胞內,由于胞內pH值高于乳酸的pKa,游離乳酸會解離成酸性陰離子和質子,對細胞造成損傷[9]。目前解決這一問題的主要方法是添加中和劑[如NaOH、Ca(OH)2、CaCO3和氨水等],但這會增加發酵成本和下游的分離純化成本。因此,工業菌株的酸脅迫是目前乳酸工業生產面臨的主要問題之一。

微生物對酸脅迫的反應是一個復雜的過程。目前,生物化學、蛋白組學和遺傳學的研究已證實了酸脅迫耐受性與各種細胞代謝調節過程密切相關。菌株對乳酸脅迫的轉錄反應很大程度上受轉錄因子的影響(圖2-a)。BAEK等[23]在S.cerevisiae中表達全局轉錄因子Haa1可促使其亞細胞定位由胞漿轉移至胞核,并誘導其靶基因ygp1、gpg1和spi1的表達,從而介導酵母對乳酸的脅迫適應[23]。sRNA可以通過與mRNA相互作用快速調節目標基因表達,在環境壓力響應過程中發揮關鍵的調控作用[45](圖2-b)。GAIDA等[46]在E.coli中過表達3種sRNAs:DsrA、RprA和ArcZ,將乳酸耐受性提高1 270倍。為了減少乳酸在胞內的積累,表達乳酸陰離子轉運蛋白基因jen1和ady2,可將陰離子輸送到細胞外,從而增加S.cerevisiae中乳酸的產量[47](圖2-c)。最后,通過加強細胞壁結構以減少孔隙度和改變質膜的脂質組成以增加膜剛性來實現細胞包膜重排,也可以增加酸脅迫耐受性[48](圖2-d)。

除了前面提到的方法,低pH值適應性實驗室進化(adaptive laboratory evolution,ALE)被應用于平衡細胞的耐酸能力與乳酸產量。在ALE獲得目標菌株后,通過系統生物學分析闡明有助于酸耐受的遺傳機制或遺傳靶標,并進行反向代謝工程將有益突變重新引入野生型或其他工程菌株,能進一步提高菌株耐酸能力和乳酸產量(圖2-e)。此外,基于隨機突變的基因組進化和可示蹤基因組進化技術已經被廣泛應用于提高酸耐受性(圖2-f)。SI等[49]開發了一種自動化多重基因組進化方法,通過結合RNA干擾和CRISPR/Cas9技術,進行多輪迭代基因組進化提高S.cerevisiae乙酸耐受性,將來也可用于提高菌株對其他酸的耐受能力。

a-應激相關轉錄因子的表達或敲除;b-sRNA調控基因表達;c-加強乳酸陰離子外排;d-增加細胞壁厚度; e-適應性實驗室進化;f-基因組進化

4.2 菌株熱脅迫耐受性的提高

在工業發酵過程中,微生物的生長代謝和發酵罐的攪拌會產生大量熱能。當發酵溫度高于某一區間時,菌株會由于新陳代謝速率加快而引起早衰,嚴重影響乳酸的產率。然而,采用高溫發酵可減少副產物的生成、降低噬菌體污染的風險,同時還能降低滅菌成本和冷卻費用。從自然界分離的嗜熱芽孢桿菌可以在50 ℃時進行乳酸的開放發酵。除此之外,大部分乳酸生產菌株都是嗜溫菌。與嗜熱菌相比,嗜溫菌在分批發酵過程通常具有更好的乳酸生產能力,因此研究其熱應激反應的分子基礎,特別是熱休克蛋白的作用及其調控機制,對提高菌株的熱脅迫耐受性具有重要指導意義。當細胞暴露于高溫環境中時,DnaK-GrpE-DnaJ和GroES-GroEL伴侶復合物對細胞膜的穩定和DNA復制等生物學過程具有重要作用。在L.lactis中過表達熱休克蛋白GroES和DnaK,可以引導蛋白質的正確折疊,從而提高乳酸乳球菌的熱脅迫耐受性并得到較高的乳酸生產率[51]。最近,LI等[52]利用CRISPR基因激活文庫篩選技術,成功應用于提升K.marxianus的熱脅迫耐受性,并闡明了一種新的耐高溫機制。研究發現,過表達脂肪酸合成代謝通路的關鍵基因OLE1可以提高不飽和脂肪酸比例,降低胞內脂質過氧化水平,從而有效提升酵母的熱脅迫耐受性。

4.3 菌株抑制劑耐受性的提高

復雜的木質纖維素在預處理過程中會產生抑制劑,如呋喃、酚類化合物、生物醇、無機離子和脂肪酸等。這些化合物能夠抑制酶的活性和細胞生長,從而影響乳酸發酵過程。通過生物脫毒可去除一部分抑制劑,但為了減少糖類在脫毒過程中的消耗,仍會殘留少量抑制劑。研究表明,L-1,2-丙二醇氧化還原酶FucO可催化糠醛還原為毒性較小的醇,因此可以通過表達天然fucO基因來提高菌株的糠醛耐受性。之后通過引入FucO同源二聚體界面L7F突變,可將酶活力提高10倍,同時糠醛代謝速率增加了一倍[53]。除此之外, LIAN等[54]將可同時進行轉錄激活、轉錄抑制和基因敲除的三功能CRISPR體系與寡核苷酸芯片技術結合,成功開發出多功能全基因組進化技術,經過3輪進化,酵母能夠在17.5 mmol/L糠醛濃度下消耗大部分的葡萄糖。此外,篩選到多個糠醛耐受性相關的新靶點,如SLX5、NUP133和GPI17等。盡管該技術目前用于乙醇發酵,但未來有望將其應用于乳酸發酵生產。通過短鏈脫氫酶CGS9114_RS09725的整合可提高P.acidilactici對香草醛的耐受性[55]。表達氧化還原酶基因ZMO1116可提高菌株對苯醌的耐受性[56]。然而,以上研究只針對單一抑制劑,在面對復雜的木質纖維素水解產物中的混合抑制劑時,其耐受性仍然不足。為此,有研究報道,在未脫毒的玉米芯水解液中經過111 d的長期ALE,可同時提高多種醛抑制劑的生物轉化能力,從而實現酸預處理玉米芯水解液一鍋法生產D-乳酸[57]。

4.4 菌株滲透脅迫耐受性的提高

微生物發酵過程中,高濃度的營養物質會導致細胞內外滲透壓產生差異,特別是當發酵罐內初始糖濃度過高時,會導致菌株生長延遲,從而影響乳酸產量和生產率。雖然補料分批發酵可以降低初始糖濃度,但提高菌株的滲透脅迫耐受性可以簡化工藝,降低成本。添加滲透保護劑(如甜菜堿和脯氨酸)是提高滲透脅迫耐受性最簡單的方法[58]。此外,通過在高濃度的甜菜糖蜜中對菌株進行ALE,能夠使菌株的糖耐受性和抗氧化能力增強,最終使乳酸生產率提高31%[58]。QI等[59]通過對葡萄糖脅迫下L.lactis的代謝組學和蛋白組學進行分析,構建了葡萄糖脅迫反應機制模型,發現L.lactis通過上調氧化還原酶活性來響應葡萄糖脅迫,從而提高葡萄糖到乳酸的代謝通量,為提高乳酸生產菌株的滲透脅迫耐受性提供了新思路。

5 結論與展望

隨著市場對乳酸的需求不斷增加,亟需開發滿足工業要求的高性能乳酸生產菌株。為了應對這一挑戰,研究人員采用合成生物學和代謝工程技術對菌株進行改造,有效提高乳酸的產量、產率、生產率以及光學純度。此外,為應對工業發酵中的極端環境,理性設計與定向進化相結合的耐受性工程已被用來提高菌株魯棒性。盡管如此,微生物細胞工廠高效合成乳酸仍存在一定挑戰,以下問題還有待進一步優化:

1)工業菌株性能的提升往往是通過生物量和目標產物的形成、氧化還原平衡和復雜的耐受調控之間的權衡來實現的。盡管GSMM為系統研究菌株代謝網絡提供了有利幫助,但仍缺乏轉錄調控信息。而全細胞模型能將細胞內所有生命活動模塊化(圖1-e),有望解決目前代謝工程存在的問題并在未來得以應用。2)大多數基因工程乳酸生產菌株在發酵廉價生物質時仍存在困難。因此,需進一步開發可利用廉價替代底物發酵的菌株以及低毒預處理技術。3)由于菌株中涉及的耐受機制大多是未知的,因此,增強菌株耐受性主要依賴于進化工程。對進化耐受菌株的耐受遺傳機制進行系統生物學分析,將有助于加快機制的解析并通過反向代謝工程應用于菌株改造。4)新型基因組進化技術為提高乳酸產量提供了新思路,但如何快速對龐大的突變庫進行篩選是目前面臨的另一個問題。未來可以結合熒光激活細胞分選技術和液滴微流控分選技術,以大幅提高基因組進化的效率。5)發酵過程中乳酸濃度和pH值對發酵至關重要,但目前還沒有準確的實時監測工具。最近,XIAO等[60]成功研發了基于轉錄因子LldR的生物傳感器BLac-6,可以同時監測Klebsillaoxytoca發酵液中L-乳酸和D-乳酸的濃度,這為未來工業發酵過程中的乳酸濃度實時監測帶來了希望。