清腎顆粒對5/6腎切除大鼠腎組織線粒體自噬及腎小管上皮-間質細胞轉化的影響*

張葉青，金華，張磊，呼琴，王億平，代明揚

1 安徽中醫藥大學 安徽合肥 230038

2 安徽中醫藥大學第一附屬醫院 安徽合肥 230031

腎纖維化（renal fibrosis，RF）是各種類型慢性腎臟?。–hronic Kidney Disease，CKD）發展過程中重要的病理生理改變，以正常腎單位丟失、大量成纖維細胞及肌成纖維細胞增生、細胞外基質堆積而導致腎小球硬化、腎小管間質纖維化為特征。腎小管上皮-間質細胞轉化（Epithelial-mesenchymal，EMT)已被確認為是RF的主要因素[1]。在EMT過程中，上皮細胞失去極性和上皮表面標記物如E-鈣黏蛋白（Ecadherin），轉而獲得間充質特征如α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），最終轉變為肌成纖維細胞，破壞腎臟結構，逐漸發展成腎纖維化[2]。線粒體自噬是一種重要線粒體質量控制機制，通過持續清理衰老和損傷的線粒體，確保線粒體能循環利用。線粒體自噬主要由PINK1/Parkin通路介導[3]。線粒體自噬與腎小管EMT之間的關系目前報道不多，通過調節線粒體自噬活性來減輕腎小管EMT進程可能成為中藥抗腎纖維化的重要靶點。本研究將采用5/6腎切除大鼠建立腎臟纖維化動物模型，觀察清腎顆粒對模型大鼠的腎組織線粒體自噬及腎小管EMT的影響，為其抗腎纖維化提供理論依據。

材料與方法

1 實驗動物

選用SPF級雄性SD大鼠20只，2月齡，體重（200±20）g，適應性飼養1周，均購自安徽醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（蘇）2022-0005。本研究通過安徽中醫藥大學倫理委員會審核（倫理批號AHUCM-rats-2022071）。

2 用藥

清腎顆粒：由安徽省中醫院制劑室生產，皖藥制字BZ20080011，批號20210215，規格10g/袋（約含生藥34g），由茵陳、丹參、生大黃、白花蛇舌草、白術、薏苡仁、澤瀉、黃連、車前草組成。

3 試劑

Wes tern一抗二抗去除液（Beyotime，批號0514-18180626）；PVDF膜（Millipore，批號R7SA9081E）；ECL超敏發光試劑盒（Thermo，批號VC298015）；山羊抗小鼠IgG（Zsbio，批號140193）；山羊抗兔IgG（Zsbio，批號202700514）；GAPDH（Zsbio，批號210040421）；Pink1（Bioss）；Parkin（Santa Cruz， 批號K1120）；LC3B（CST，批號13）；α-SMA（bioss，批號AG03286338）。

4 儀器

離心機（上海和欣科教設備有限公司）；電泳儀、電泳槽、轉膜儀（上海天能科技有限公司）；自動曝光儀（上海培清科技有限公司）；熒光顯微鏡（日本Motic BA410E）；激光共聚焦成像分析系統（美國PerkinElmer公司）；透射電子顯微鏡（日本電子JEM-1400 Flash）。

5 方法

5.1 大鼠模型建立及分組 SPF級雄性SD大鼠30只，2月齡，體重（200±20）g，適應性飼養1周，隨機分為假手術組、模型組、清腎顆粒組，每組各10只。除假手術組外，其余20只大鼠均制作5/6腎切除模型。采用腹腔注射以2%的戊巴比妥（0.2mL/100g）對大鼠進行麻醉，俯臥位固定于手術臺上，從距左脊肋骨1.5cm處斜向外方切口，暴露左腎，分離腎周圍脂肪囊后，弧行切除腎上、下極各1/3，明膠海綿壓迫止血1min，復位腎臟，縫合。1周后切除整個右腎。共切除5/6腎臟。假手術組只進行左右腎包膜剝離，保留腎臟及腎上腺。各組術后予青霉素預防感染。

5.2 大鼠給藥方法、標本采集 各組均在造模后第1天開始灌胃，清腎顆粒組給予清腎顆粒水溶液按8.0g/kg·d灌胃，1次/d，每次3mL。假手術組、模型組大鼠用等量蒸餾水（3mL）灌胃。連續給藥8周。無菌采取腹主動脈血，代謝籠留取24h尿液并記錄尿量，留取左側腎臟。將部分腎臟放入液氮罐速凍后置于-80℃冰箱中保存，用于提取蛋白；部分腎臟用生理鹽水沖洗干凈后置于冰上，OTC包埋后制作冰凍切片，用于免疫熒光檢測；部分腎臟置于10%福爾馬林液中固定，制作石蠟切片，用于光鏡觀察；部分腎臟制作超薄切片，用于透射電鏡觀察線粒體超微結構。

5.3 檢測指標

5.3.1 ELISA法檢測血肌酐（Serum creatinine， Scr）、尿肌酐（Urine creatinine， Ucr）濃度 按ELISA試劑盒說明書操作，并根據Scr、Ucr濃度及24h尿量計算內生肌酐清除率（endogenous creatinine clearance rate， Ccr），按體重進行校正。校正后Ccr= Ucr濃度（μmol/L）×24h尿量（mL）/（Scr濃度（μmol/L）×1440min）/體重（kg）。

5.3.2 Western blot法檢測腎組織中Pink1、Parkin、LC3-Ⅱ、α-SMA蛋白表達 腎臟50mg加入1ml組織裂解液（RIPA）及蛋白酶抑制劑制備組織勻漿，提取總蛋白并測量蛋白濃度。分離總蛋白，電泳并轉膜。封閉2h，TBST洗膜，加入一抗孵育，4℃過夜。第2天洗膜后，將膜與適當的二抗室溫輕搖孵育1h后洗膜。使用ECL發光試劑盒來檢測蛋白。使用Image J軟件以目標蛋白與內參照GAPDH的灰度值比值做統計分析。

5.3.3 免疫熒光法檢測腎組織中LC3-Ⅱ和線粒體膜蛋白VDAC1共定位表達 腎組織OTC包埋后制5μm冰凍切片，冰丙酮室溫固定5min后，先用PBS（0.01mol/L）清洗3次（每次10min），再用正常山羊血清封閉30min（37℃），傾去勿洗；然后滴加一抗（VDAC1）孵育（4℃，過夜），次日拿出濕盒，棄一抗，PBS清洗3次（每次3min），然后滴加熒光標記的二抗，室溫下孵育60min；PBS清洗3次（每次3min），然后滴加一抗（LC3Ⅱ），37℃溫箱中孵育60min；PBS清洗3次（每次3min），然后滴二抗，室溫下孵育60min；PBS清洗3次（每次3min），然后用DAPI染色大約2min，再用PBS充分淋洗1次，3min；激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

5.3.4 HE和Masson染色光鏡觀察大鼠腎臟病理改變 腎臟組織標本經常規固定、包埋，制成厚度2μm的組織切片，行HE、Masson染色。

5.3.5 透射電鏡觀察腎小管上皮細胞中線粒體的超微結構 腎臟組織用3%戊二醛固定、PBS漂洗、1%鋨酸后固定1h，再經過酒精、丙酮逐級脫水，環氧樹脂618包埋，甲苯胺藍染色后定位、切片，制成厚度約50～70nm的超薄切片，最后經醋酸鈾、檸檬酸鉛分別染色后，利用透射電鏡下觀察腎小管上皮細胞線粒體的形態及結構變化。

6 統計學方法

所有數據均采用 SPSS 26.0 軟件進行統計分析。計量資料以（±s）表示。資料符合正態性且方差齊用t檢驗及單因素分析法分析比較；若資料不符合正態分布或方差不齊則采用非參數檢驗。P＜0.05認為差異有顯著統計學意義，P＜0.01認為差異有非常顯著意義。

結 果

1 各組大鼠Scr、Ccr比較

與假手術組比較，模型組大鼠的Scr濃度顯著升高，而Ccr顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，清腎顆粒組大鼠的Scr濃度顯著降低，而Ccr顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。假手術組1033.42±5.395.36±1.54模型組7124.96±14.971.42±0.60清腎顆粒組877.90±10.692.27±0.64

表1 各組大鼠Scr、Ccr比較（±s）

表1 各組大鼠Scr、Ccr比較（±s）

分組只數Scr/μmol·L-1Ccr/ml·min-1·kg-1

2 各組大鼠腎組織中Pink1、Parkin、LC3-Ⅱ、α-SMA蛋白表達比較

與假手術組比較，模型組大鼠的線粒體自噬相關蛋白Pink1、Parkin、LC3Ⅱ表達量均顯著下降，腎小管EMT標志蛋白α-SMA顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，清腎顆粒組大鼠的Pink1、LC3Ⅱ蛋白表達量顯著升高，α-SMA表達量顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），Parkin亦有所升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2，圖1。

圖1 各組大鼠腎組織中Pink1、Parkin、LC3Ⅱ、α-SMA蛋白表達比較（Western blot）

表2 各組大鼠腎組織中Pink1、Pa rkin、LC3-Ⅱ、α-SMA蛋白表達比較（±s）

表2 各組大鼠腎組織中Pink1、Pa rkin、LC3-Ⅱ、α-SMA蛋白表達比較（±s）

分組例數Pink1ParkinLC3-Ⅱα-SMA假手術組101.86±0.232.18±0.132.11±0.331.39±0.40模型組71.41±0.221.66±0.371.10±0.202.47±0.24清腎顆粒組81.66±0.101.85±0.501.48±0.161.91±0.30

3 各組大鼠測腎組織中LC3-Ⅱ和線粒體膜蛋白VDAC1共定位表達情況

與假手術組比較，模型組大鼠（5/6腎切除）腎小管上皮細胞中線粒體標記物VDAC1和自噬標記物LC3-Ⅱ的共定位表達顯著升高；與模型組比較，清腎顆粒組大鼠腎小管上皮細胞中VDAC1和LC3-Ⅱ共定位表達進一步顯著升高。見圖2。

圖2 免疫熒光法檢測腎小管LC3Ⅱ和VDAC1共定位表達情況（×200）

4 各組大鼠腎臟病理改變

HE和Masson染色后，光鏡觀察發現：假手術組大鼠的腎小球未見萎縮，腎小管管腔大而規則，呈疊瓦狀分布，腎間質未見明顯炎性細胞浸潤。模型組大鼠可見腎間質區域大量纖維化及炎性細胞浸潤，纖維化區域呈藍染膠原纖維分布；部分腎小球硬化，腎小管管腔擴張及上皮細胞空泡變性，甚至萎縮、壞死及脫落。清腎顆粒組大鼠腎臟病理損害明顯減輕，纖維化程度逐漸減輕，藍染膠原纖維及炎性細胞浸潤減少。見圖3。

圖3 各組大鼠腎臟組織光鏡觀察（HE和Masson染色）

5 各組大鼠腎小管上皮細胞中線粒體的超微結構

透射電鏡觀察顯示：假手術組大鼠腎小管上皮細胞中的線粒體排列整齊、完整，線粒體脊清晰、連續。模型組大鼠（5/6腎切除）腎小管上皮細胞中的線粒體損傷明顯，細胞核凋亡，組織壞死，大量成纖維細胞生成（紅色箭頭）；線粒體脊斷裂、腫脹、空泡樣變（紅色方框內）。清腎顆粒組大鼠腎小管上皮細胞中的線粒體損傷較模型組減輕（紅色方框內）；可見自噬線粒體（黃色箭頭）。見圖4。

圖4 透射電鏡檢測各組大鼠腎小管上皮細胞中線粒體的超微結構

討 論

CKD主要病理改變為腎臟纖維化，而腎小管EMT是引起腎間質纖維化（RIF）的關鍵事件，表現為上皮細胞獲得間質細胞表型、間質細胞標志物（如α-SMA）表達增多等[4]。線粒體自噬在纖維化疾病中起關鍵作用，其通過減少線粒體釋放活性氧、促凋亡物質，緩解炎癥和氧化應激損傷，減少細胞凋亡，發揮抗纖維化的作用[5]。腎小管上皮細胞富含線粒體，對缺血缺氧十分敏感，線粒體自噬介導的線粒體質量控制對于調節腎臟中的細胞穩態是極其關鍵的[6]。線粒體自噬在急性腎損傷和慢性腎臟疾病的進展中起著重要作用。研究表明，通過抑制PINK1/Parkin通路負性調節線粒體自噬，能夠加重腎缺血再灌注損傷[7]。通過抑制糖尿病腎病中PINK1介導的線粒體自噬，能夠加重腎纖維化進程[8]。而通過介導線粒體自噬活性增強，能夠抑制ROS和NLRP3炎癥小體激活，進而發揮抗腎纖維化作用[9]。因此，恢復線粒體自噬平衡作為治療腎間質纖維化的藥理學靶點的可能性，為更有效地抗腎臟纖維化、延緩慢性腎臟病的進展提供新思路[10]。

PINK1/Parkin通路是介導線粒體自噬的主要信號通路，有研究發現PINK1/Parkin介導的線粒體自噬是清除受損線粒體的主要通路，上調該通路可激活線粒體自噬，對保護腎功能，對改善由缺血、缺氧引起的細胞穩態失衡有重要作用[11-12]。PINK1和Parkin位于同一條信號通路上，且PINK1是使得parkin轉位至受損線粒體上募集的關鍵蛋白[13]。當線粒體受到破壞時，PINK1會堆積在線粒體外膜上并完成自我激活，將胞漿里的Parkin蛋白分子募集到受損傷的線粒體中，此時，PINK1和Parkin通過泛素磷酸化激活了線粒體自噬機制，隨后蓄積P62蛋白，P62與LC3-Ⅱ結合并相互作用，促使線粒體自噬體的形成[14-15]。同時，在自噬起始時Beclin1通過PI3k和Atg14形成三聚體，并不斷招募自噬相關蛋白介導線粒體自噬[16-17]。最后，細胞質基質型LC3（即LC3-Ⅰ）會酶解掉一小段多肽，轉變為（自噬體）膜型（即LC3-Ⅱ），LC3-Ⅱ蛋白能促使線粒體自噬體與溶酶體融合，形成成熟的線粒體自噬溶酶體，啟動受損線粒體的降解程序[18]。因此LC3-Ⅱ在自噬體形成中發揮至關重要的作用，可反映自噬活動，是研究自噬活動的特異性指標。5/6腎切除大鼠是經典的腎間質纖維化動物模型，本研究結果發現，5/6腎切除大鼠除表現為腎間質纖維化之外，還可見部分腎小球硬化、腎小管萎縮；模型組大鼠的Scr濃度顯著升高，而Ccr顯著降低，提示腎功能損害嚴重。研究結果還發現，在模型組大鼠腎組織中Pink1、Parkin、LC3Ⅱ表達顯著降低，α-SMA表達顯著升高；模型組大鼠的腎小管上皮細胞中線粒體標記物VDAC1和自噬標記物LC3-Ⅱ的共定位表達顯著升高；透射電鏡也顯示模型組大鼠的腎小管上皮細胞中的線粒體損傷明顯，細胞核凋亡，組織壞死，大量成纖維細胞生成。上述研究結果提示在腎小管轉分化進程中，腎小管上皮細胞中線粒體發生損傷，Pink1/Parkin通路活性及其介導的線粒體自噬活性是下降的。

針對慢性腎臟病“濕熱傷腎、濕熱與瘀交結”的病機，本研究團隊開發出具有清熱化濕祛瘀功效的中藥清腎顆粒并成功應用于臨床治療CKD，取得良好臨床療效。多中心、隨機對照臨床試驗證實清腎顆粒能夠有效改善CKD濕熱證患者的臨床癥狀、提高生活質量、延緩腎衰竭進展；有效改善腎性貧血、營養不良、鈣磷代謝紊亂、胃腸功能紊亂等CKD并發癥；且安全性良好[19]。前期研究也發現，清腎顆粒治療慢性腎臟病患者和抗腎纖維化機制中具有多環節、多靶點、多途徑作用特點[20-25]。本實驗結果也發現，清腎顆粒能夠改善5/6腎切除大鼠的Ccr，并能夠增強Pink1/Parkin介導的腎小管上皮細胞中線粒體自噬活性，進而起到減輕腎小管EMT進程，發揮抗腎臟纖維化作用，這為中醫藥防治CKD提供新的思路和方向。