金復康口服液對吉非替尼耐藥肺腺癌H1975細胞有氧糖酵解的影響

張 軼,賈 方,王秋月,崔文靜,王菊勇

(上海中醫藥大學附屬龍華醫院,上海 200032)

肺癌作為全球主要的公共衛生問題嚴重威脅人類生命健康,據世界衛生組織國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer, IARC)發布的全球最新癌癥負擔數據統計顯示,我國肺癌新發和死亡人數分別占全球的37.0%和39.8%[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)作為最常見的病理類型,惡性程度高且局部浸潤和血行轉移較早,80%患者明確診斷時已屬中晚期[2]。以吉非替尼為代表的表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)在治療NSCLC方面具有較好的療效,但使用靶向治療的患者一般在6～12個月后出現獲得性耐藥,約50%是由于EGFR基因第20號外顯子T790M錯義突變所致[3]。腫瘤耐藥的同時內源性代謝譜發生了顯著改變,有氧糖酵解即Warburg效應是惡性腫瘤代謝重編程的重要體現[4]。己糖激酶2(HK2)、P型磷酸果糖激酶(PFKP)、M2型丙酮酸激酶(PKM2)作為糖酵解途徑的主要限速酶,其活性失調和過表達與靶向治療耐藥的產生有關[5]。有氧糖酵解會抑制線粒體功能,損傷線粒體膜電位并減少活性氧(ROS)產生,從而減輕ROS的細胞毒性并增加對靶向藥物的抗性[6]。因此,通過調節腫瘤細胞有氧糖酵解可能是逆轉靶向治療耐藥的可行手段。金復康口服液是由上海中醫藥大學附屬龍華醫院國醫大師劉嘉湘教授在三十多年臨床實踐基礎上,以“扶正治癌”學術思想理論體系為依據研制的抗肺癌專用方,本課題組前期研究顯示該制劑能干預肺癌糖代謝過程,增加耐吉非替尼肺癌裸鼠移植瘤的敏感性,抑制腫瘤生長[7-8]。本實驗通過觀察金復康口服液對吉非替尼耐藥肺腺癌H1975細胞株的增殖抑制作用及對細胞葡萄糖攝取能力、乳酸生成量、限速酶的活性及表達、線粒體膜電位和ROS水平的影響,從干預腫瘤細胞有氧糖酵解以調控能量代謝的角度探討金復康口服液增加肺癌對吉非替尼敏感性的作用機制,以期為臨床延緩肺癌靶向耐藥提供新思路。

1 實驗材料與方法

1.1細胞與藥品 人肺腺癌H1975細胞株(EGFR-T790M/L858R雙突變的吉非替尼耐藥細胞株,購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫);金復康口服液(吉林三九金復康藥液有限公司,批號：180302,生藥含量1 g/mL),吉非替尼(英國阿斯利康公司,批號：S1025,規格：250 mg/片)。

1.2主要試劑與儀器 胎牛血清(Gibco公司),RPMI-1640培養基、PBS(Hyclone公司),HK2、PKM2單克隆鼠抗體(Santa Cruz公司),PFKP多克隆兔抗體(上海生工),內參抗體GAPDH(Proteintrch公司),山羊抗鼠辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗、山羊抗兔HRP二抗(Arigo公司),CCK-8試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒(上海碧云天),己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)活性檢測試劑盒(北京索萊寶),2-脫氧葡萄糖類似物(2-NBDG)熒光探針(AAT公司),乳酸檢測試劑盒(南京建成); 細胞培養箱(日本SANYO),熒光倒置顯微鏡(德國Leica),冷凍干燥機(北京博醫康),超聲破碎細胞粉碎機(寧波新芝),多功能酶標儀(美國Molecular Devices),蛋白垂直電泳系統(美國Bio-Rad),化學發光成像系統(瑞士Tecan)。

1.3細胞培養方法 人肺腺癌H1975細胞使用含10%胎牛血清、1%丙酮酸鈉和1%青鏈霉素的RPMI-1640完全培養基培養于37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養箱中,待細胞貼壁生長覆蓋率達80%～90%時,用0.25%胰蛋白酶消化后按照1∶2比例傳代,連續培養3～5代后,收集對數生長期內的細胞進行實驗。

1.4藥物制備方法 將金復康口服液置于-80 ℃冰箱中凍存過夜,放入預冷2 h后的冷凍干燥機內,36 h后收取凍干粉并稱量,每毫升金復康口服液獲取凍干粉0.244 g,以雙蒸水溶解0.22 μm無菌過濾器濾過后分裝,保存于4 ℃冰箱備用[9]。

1.5細胞分組及干預 取對數生長期的H1975細胞,以1×106個/孔接種于6孔板內,細胞完全貼壁后分為4組,空白組常規培養,金復康口服液組加入1 g/L金復康口服液培養,吉非替尼組加入5 μmol/L吉非替尼培養,聯合用藥組加入1 g/L金復康口服液和5 μmol/L吉非替尼培養,各組培養48 h后進行后續實驗。

1.6檢測指標及方法

1.6.1細胞增殖情況 取對數生長期的H1975細胞制成單細胞懸液,以5×103個/孔接種于96孔板內,37 ℃細胞培養箱中培養24 h后至細胞完全貼壁,每孔加入200 μL含不同濃度金復康口服液(0.25,0.5,1,2,3 g/L)的培養基,每個濃度設置3個平行復孔,并設調零孔和不含藥物的空白孔。分別培養24 h、48 h、72 h后吸棄藥液,加入含10% CCK-8溶液的培養基100 μL,37 ℃培養箱孵育2 h,充分震蕩后在酶標儀450 nm波長處檢測各孔吸光度A。細胞增殖抑制率=(1-A藥物組/A空白組)×100%。另分別采用不同濃度吉非替尼(2.5,5,10,20,40 μmol/L)和不同濃度吉非替尼(2.5,5,10,20,40 μmol/L)聯合濃度為1 g/L的金復康口服液處理H1975細胞48 h后,按上述方法加入CCK-8試劑檢測細胞增殖抑制率。

1.6.2葡萄糖攝取能力 將對數生長期的H1975細胞按“1.5”分組及處理方式干預48 h后,采用無糖無血清培養基饑餓處理2 h,加入200 μmol/L的2-NBDG溶液,37 ℃避光孵育30 min,將待測細胞密度調整為5×105個/mL,預冷的PBS清洗2次,重懸后取200 μL細胞懸液移入黑色不透光96孔板內,于熒光酶標儀激發波長467 nm、發射波長538 nm條件下檢測各組細胞熒光強度。以細胞在30 min內吸收2-NBDG的平均熒光強度為葡萄糖相對攝取量,2-NBDG平均熒光強度=熒光強度測定值÷細胞數目。

1.6.3乳酸生成量 收集各處理組細胞培養基,按照乳酸試劑盒操作說明配制試劑,在空白管、標準管和測定管中分別加入20 μL雙蒸水、20 μL標準品和20 μL各組待測樣品,各管內加入酶工作液1 mL和顯色液200 μL,37 ℃ 水浴10 min后加入2 mL反應終止液,采用酶標儀檢測各樣品在530 nm波長處吸光度A,乳酸生成量(mmol/L)=(A測定管-A空白管)/(A標準管-A空白管)× 標準品濃度(3 mmol/L)× 樣本測試前的稀釋倍數。

1.6.4糖酵解關鍵限速酶活性 取各組處理后的細胞,胰酶消化后按比例加入裂解液,200 W功率超聲波破碎3 s,間隔10 s,重復30次以使細胞充分破碎,離心后抽取上清,按照試劑盒說明書加入相應試劑,在酶標儀340 nm波長處檢測各樣本吸光度A,計算HK、PFK、PK活性。

1.6.5HK2、PFKP、PKM2蛋白表達情況 采用Western blot法檢測：取各組處理后的細胞,加入RIPA裂解液冰上裂解30 min后收集總蛋白樣品,4 ℃ 15 000 r/min離心15 min,抽取上清,BCA法蛋白定量后加入上樣緩沖液,煮沸5 min使蛋白變性,行SDS-PAGE分離后將蛋白轉移至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,加入一抗4 ℃搖床孵育過夜,TBST洗膜3次,加入二抗室溫孵育1 h,洗膜后進行ECL底物發光。用Image J軟件分析各條帶灰度值,以GAPDH作為內參檢測蛋白。

1.6.6線粒體膜電位 將對數生長期的H1975細胞以1×104個/孔接種于96孔板內,按“1.5”分組及處理方式干預48 h后,每孔加入等比例的JC-1染色工作液和培養基,充分混勻后37 ℃培養箱中避光孵育20 min,孵育結束后用JC-1染色緩沖液(1×)清洗2次,立即置于熒光顯微鏡下觀察。當線粒體膜電位較高時,JC-1以紅色熒光的聚合物形式聚集在線粒體基質內;線粒體膜電位降低時,JC-1表現為綠色熒光的單體形式。

1.6.7ROS水平 收集各組處理后的H1975細胞,加入10 μmol/L的DCFH-DA工作液,37 ℃培養箱中避光孵育30 min,DCFH-DA熒光探針裝載結束后用無血清培養基清洗3次,重懸后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照,于熒光酶標儀激發波長488 nm、發射波長525 nm條件下檢測各組細胞熒光強度。

1.7統計學方法 所有數據采用SPSS 25.0軟件進行分析。計量資料符合正態性和方差齊性的,組間比較采用單因素方差分析,之后兩兩比較進行LSD-t檢驗;不符合方差齊性的采用秩和檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1H1975細胞增殖情況 隨著給藥時間的延長和藥物濃度的增加,金復康口服液對H1975細胞的生長抑制作用呈時間和劑量依賴性增強,差異均有統計學意義(P均<0.05),見圖1。與不同濃度吉非替尼單獨作用48 h比較 ,相應濃度吉非替尼聯合金復康口服液作用后的H1975細胞增殖抑制率均更高(P均<0.05),見圖2。

圖1 不同濃度金復康口服液作用不同時間H1975細胞增殖抑制率

圖2 不同濃度吉非替尼單用與不同濃度吉非替尼聯合金復康口服液作用48 h后H1975細胞增殖抑制率

2.2H1975細胞葡萄糖攝取及乳酸生成情況 與空白組比較,各給藥組H1975細胞葡萄糖相對攝取量均有所下降,聯合用藥組下降趨勢更為明顯,但各組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05);各給藥組乳酸生成量均明顯低于空白組(P均<0.05),且聯合用藥組明顯低于吉非替尼組和金復康口服液組(P均<0.05),吉非替尼組與金復康口服液組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組H1975細胞葡萄糖攝取及乳酸生成情況比較

2.3H1975細胞中糖酵解關鍵限速酶活性 與空白組比較,吉非替尼組PFK、PK活性,金復康口服液組HK、PFK活性,聯合用藥組HK、PFK、PK活性均明顯降低,差異均有統計學意義(P均<0.05);金復康口服液組與聯合用藥組HK、PFK活性均明顯低于吉非替尼組(P均<0.05)。見表2

2.4H1975細胞中HK2、PFKP、PKM2蛋白表達情況 金復康口服液組和聯合用藥組HK2、PFKP、PKM2蛋白相對表達量及吉非替尼組PFKP蛋白相對表達量均明顯低于空白組(P均<0.05);金復康口服液組和聯合用藥組HK2、PFKP、PKM2蛋白相對表達量均明顯低于吉非替尼組(P均<0.05)。見圖3及表3。

表3 各組H1975細胞中HK2、PFKP和PKM2蛋白相對表達量比較

圖3 各組H1975細胞中HK2、PFKP和PKM2蛋白表達情況

2.5H1975細胞線粒體膜電位 與空白組比較,各給藥組細胞綠色熒光增加(細胞線粒體膜電位下降),且聯合用藥組細胞綠色熒光增加更明顯。見圖4。

圖4 熒光顯微鏡下各組H1975細胞線粒體膜電位情況(JC-1熒光探針標記,×200)

2.6H1975細胞中ROS熒光探針標記情況 與空白組比較,各給藥組ROS明顯增加,且聯合用藥組增加更明顯。見圖5。

圖5 熒光顯微鏡下各組H1975細胞中ROS情況(DCFH-DA熒光探針標記,×100)

3 討 論

肺癌在中醫古籍中多見于“肺積”“肺癰”“痰飲”“息賁”等論述中,正氣虛損是本病發生發展的根本原因和病機演變的關鍵[10]?！鹅`樞·百病始生》曰：“壯人無積,虛人則有之?！薄夺t宗必讀》指出：“積之成者,正氣不足,而后邪氣據之?！狈螢閶膳K,喜潤惡燥,邪毒郁肺后久而化熱傷陰,耗損正氣,隨之形成癌瘤,正氣虛損又助癌生長,故肺癌多為本虛邪盛所致,虛以陰虛、氣陰兩虛多見,實以氣滯、血瘀、痰凝、毒聚為主[11]。國醫大師劉嘉湘教授在辨證論治的指導原則下,提出道、法、術、理完備的“扶正治癌”學術思想體系,治療肺癌多選用補益虛損不足的中藥以培植本元,調節人體陰陽氣血和臟腑經絡的生理功能,增強機體內在抗病能力,從而抑制癌癥發展[12]。金復康口服液由生黃芪、北沙參、女貞子、天冬、麥冬、淫羊藿、石見穿、石上柏、七葉一枝花、絞股藍、山茱萸、葫蘆巴12味益氣養陰、補腎固本、清熱解毒的中藥組成,能明顯改善氣陰兩虛型NSCLC患者的臨床癥狀,可抑制腫瘤增殖和轉移,增加化療療效并減輕不良反應,延長患者生存期[13]?；A研究表明,金復康口服液可抑制NSCLC細胞的體外增殖和克隆形成,可改善對吉非替尼獲得性耐藥人肺腺癌細胞株PC9R的凋亡抵抗,增加其對吉非替尼的敏感性[14]。

葡萄糖攝取增加和代謝途徑的改變是腫瘤細胞惡性進程的重要標志。有氧糖酵解作為腫瘤細胞糖代謝的主要特征,表現為腫瘤細胞在氧氣充足的條件下通過糖酵解途徑而非氧化磷酸化產生ATP和乳酸的過程,已在肺癌、乳腺癌、結腸癌等多種惡性腫瘤中驗證,其中間代謝產物及終產物乳酸形成的酸性微環境為腫瘤細胞的迅速生長和遠處轉移提供了條件,細胞內乳酸鹽的不斷累積,能減弱EGFR-TKIs對細胞生長的抑制作用[15]。研究表明,抑制HK2活性或表達能顯著降低H1975細胞的糖酵解水平,減少細胞內環境中ATP產量從而抑制其增殖,逆轉其對奧希替尼的獲得性耐藥[16]。Lee等[17]證實EGFR活化可導致PFKP磷酸化,激活PI3K/Akt途徑正反饋調節PFK1的表達,促進有氧糖酵解發生。PKM2的活性降低有助于克服缺氧誘導的腫瘤細胞耐藥性,其特定抑制劑紫草素能增加吉非替尼在EGFR野生型NSCLC細胞中的抗腫瘤作用[18]。腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑奧拉帕尼可靶向細胞核PKM2,增加EGFR突變肺癌細胞對吉非替尼的敏感性[19]。因此,調節糖酵解關鍵限速酶的活性及表達或能改善肺癌EGFR-TKIs耐藥。

本研究以EGFR基因T790M-L858R雙突變對吉非替尼耐藥的H1975肺癌細胞株為研究對象,首先對金復康口服液、吉非替尼及兩藥聯合的抗腫瘤作用進行觀察。CCK-8細胞活性檢測結果顯示,金復康口服液呈時間和劑量依賴性地抑制H1975細胞增殖,且與吉非替尼聯合使用抑制作用更顯著,考慮金復康口服液能增加耐藥細胞對吉非替尼的敏感性。為從有氧糖酵解的角度探索其增敏機制,本研究采用帶有熒光標記的葡萄糖類似物2-NBDG檢測細胞葡萄糖攝取能力,觀察乳酸生成量,檢測糖酵解關鍵限速酶的活性和表達水平,結果與空白組和吉非替尼組相比,聯合用藥組細胞葡萄糖攝取能力有下降趨勢,乳酸生成量明顯減少,HK2、PFKP、PKM2蛋白表達及活性下調更為顯著,表明金復康口服液可能通過抑制有氧糖酵解途徑增加耐藥細胞對吉非替尼的敏感性,抑制腫瘤增殖。

腫瘤細胞有氧糖酵解現象的產生主要歸因于線粒體呼吸功能抑制導致氧化磷酸化異常,促使細胞通過糖酵解途徑生成ATP[20]。線粒體功能障礙主要表現為線粒體膜電位的下降,通透性增強,釋放細胞色素C等凋亡相關蛋白,引發細胞早期凋亡,線粒體膜電位的穩定與腫瘤細胞多藥耐藥有關[21-22]。此外,線粒體受損是導致ROS過度產生的主要原因之一,但持續糖酵解表型的癌細胞通常具有強大的穩態機制來維持氧化還原平衡,如內源性PKM2的Ser37位點磷酸化后表現出強烈的抗氧化特性,促進ROS代謝過程,并介導糖酵解中間產物進入糖代謝旁路途徑分解以阻止ROS合成,抑制了由線粒體受損導致的ROS累積,與腫瘤細胞對靶向藥誘導的凋亡耐受有關[23-24]。研究指出上調ROS水平能恢復肺腺癌細胞HCC827和PC9對厄洛替尼的敏感性,促進ROS的生成或為克服腫瘤細胞多藥耐藥的途徑之一[25]。因此,本研究進一步探索了金復康口服液聯合吉非替尼對細胞線粒體膜電位和ROS水平的影響。結果顯示,兩藥聯合使用較單藥能顯著降低線粒體膜電位,提高細胞內ROS含量,表明金復康口服液可能通過損傷H1975細胞線粒體功能以改善吉非替尼耐藥。

綜上所述,金復康口服液能通過降低肺癌細胞葡萄糖攝取能力,降低糖酵解通路關鍵限速酶HK、PFK、PK的活性及HK2、PFKP、PKM2蛋白表達,減少乳酸生成,抑制有氧糖酵解過程,同時損傷線粒體膜電位并促進ROS累積,影響線粒體功能,增加耐藥細胞對吉非替尼的敏感性。本研究為中藥復方金復康口服液調節有氧糖酵解抑制肺癌生長提供了一定的實驗依據,為中醫藥延緩腫瘤靶向耐藥的治療提供了新思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。