萆薢分清顆粒對單側輸尿管梗阻腎纖維化大鼠mTOR、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達影響研究

李根生,馬鴻斌,魏錦慧,何彩蘋,翟書玲,馬海蘭

(1.甘肅中醫藥大學,甘肅 蘭州 730000;2. 甘肅中醫藥大學附屬醫院,甘肅 蘭州 730020)

腎纖維化是慢性腎臟病(CKD)進展至終末期腎臟病(ESRD)的重要環節,是CKD 持續進行性進展,甚至病程不可逆的重要原因[1]?，F代醫學研究認為,腎纖維化的發生與多種啟動因素有關,如血流動力學的改變、腎小球濾過膜受損、大量蛋白尿、免疫炎癥反應、氧化應激、相關信號通路被激活等均可造成腎臟損傷,致使正常的腎單位丟失,大量成纖維及肌成纖維細胞增生,細胞外基質(ECM)過度沉積,導致腎小球硬化、腎小管及間質纖維化,腎功能進行性減退[2-5]。ECM過度沉積是腎纖維化發生發展的重要病理環節,正常情況下腎臟組織中ECM合成與降解處于動態平衡之中,在炎癥、創傷、有毒物質等的刺激下,ECM的合成與降解失衡,促纖維化細胞因子促使ECM合成增多,降解酶系調控減弱致使ECM降解減少,由此導致大量ECM聚集,導致腎纖維化的發生[6]。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)是誘導ECM生成的主要因素,也是ECM的主要成分,三者可共同調節細胞生長、增殖及ECM沉積[7]。因此,開展對mTOR、α-SMA、Col-Ⅰ的研究,對于防治腎纖維化具有重要意義。目前對于腎纖維化的治療主要為控制血壓、血糖、血脂,糾正腎性貧血,鈣磷調節等對癥治療,對于已進展至 ESRD 的患者,以腎臟替代療法為主,其他如基因治療、細胞因子治療、干細胞治療、作用于轉化生長因子-β1(TGF-β1) 的具有抗腎臟纖維化活性的藥物與化合物治療方法及方式目前多數在實驗研究階段。劉寶厚教授認為“濕熱不除,蛋白難消”“瘀血不去,腎氣難復”,導師馬鴻斌主任醫師臨床中結合劉教授思想,將程氏萆薢分清飲加減化裁用以治療腎纖維化,發現該方可以起到保護健存腎功能、延緩腎纖維化進展的作用。本研究通過制備腎纖維化大鼠模型,探討了萆薢分清顆粒對于腎纖維化相關蛋白mTOR、α-SMA、Col-Ⅰ的調控作用,旨在為該方藥臨床治療腎纖維化提供科學的實驗依據。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級SD雄性大鼠60只,6周齡,體重(200±20) g,購于斯貝福(北京)生物技術有限公司,動物合格證號：No.110324220103707262,許可證號：SCXK(京)2019-0010。 飼養條件：自然光照,溫度 21～23 ℃,相對濕度 45%～55%。動物實驗經甘肅中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準執行(2021-219)。

1.2實驗藥物 萆薢分清顆粒：由綿萆薢 12 g、茯苓 15 g、關黃柏 12 g、丹參 12 g、車前草 30 g、續斷 12 g、槲寄生 12 g、石菖蒲 10 g、甘草 10 g組成,中藥配方顆粒為北京康仁堂藥業有限公司生產,購于甘肅中醫藥大學附屬醫院制劑中心。氯沙坦鉀片：杭州默沙東制藥有限公司,國藥準字H20000371,批號：T034889。

1.3主要試劑及儀器 α-SMA Rabbit mAb (ABclonal,貨號：4000000298),mTOR Rabbit pAb(ABclonal,貨號：5500019267),Col-Ⅰ Rabbit pAb(ABclonal,貨號：5500005998),BCA 蛋白定量試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司,貨號：20191022),RIPA裂解液(Servicebio,貨號：CR2101120),ECL發光液(Servicebio,貨號：CR2012200),預染Marker(Thermo scientific,貨號：01011775),Masson 染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號：G1340),HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號：G1120)。臺式電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏設備公司,101-1AB),高速冷凍離心機(德國 Eppendor,5424R),酶標儀(美國 BioRad 公司,iMark),化學發光成像儀(北京賽智科技有限公,MiniChemi 610),Western blot 轉膜儀(北京六一生物科技公司,DYCZ-40G),Western blot 電泳儀(北京六一生物科技公司,DYCZ-25D),包埋機(浙江省金華市科迪儀器,KD-BM),切片機(德國,LEICA2016),超低溫冰箱(中科美菱低溫科技公司,DW-HL528),搖床(美國 SCILOGEX ,SK-O180-E),全自動生化分析儀(瑞士 Roche 公司,Cobasc701),顯微成像系統(寧波舜宇儀器有限公司,RX50),分析天平(賽多利斯科學儀器公司,BSA224s)。

1.4實驗方法 60只大鼠適應性喂養1周后,隨機取10只作為空白組,其余50只采用單側輸尿管梗阻法制備腎纖維化模型。造模成功后,采用隨機數字表法將50只大鼠隨機分為模型組、氯沙坦組和萆薢分清高、中、低劑量組,每組10只,分離飼養。造模成功后次日開始,萆薢分清高、中、低劑量組分別給予13.12 mL/(kg·d)、6.56 mL/(kg·d)、3.28 mL/(kg·d)萆薢分清顆粒溶液灌胃[大鼠的等效劑量相當于人的6.3倍,萆薢分清顆粒成人(體重60 kg)用量為125 g/d,大鼠的等效劑量為13.125 g/(kg·d),制備為2 g/mL 溶液,則需要6.56 mL/(kg·d),按此劑量計算高、低劑量],氯沙坦組給予氯沙坦2.62 mL/(kg·d)灌胃,空白組和模型組給予等量生理鹽水灌胃,均1次/d,根據大鼠體重適當調整劑量,最大灌胃量不超過5 mL/d,連續灌胃4周。

1.5檢測指標及方法

1.5.1尿白蛋白與尿肌酐的比值(ACR)和24 h尿蛋白量 灌胃4周后,收集大鼠隨機尿及24 h尿液,分別用以檢測ACR和24 h尿蛋白量。

1.5.2血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)水平 灌胃4周結束后,各組大鼠稱重、麻醉,心尖采血,取血5～7 mL,靜置30 min后離心取上層血清,放于-80 ℃冰箱保存。取凍存的血清,使用全自動生化分析儀檢測SCr、BUN。

1.5.3腎組織病理形態 取血完畢后,打開腹腔,鈍性分離腎周圍組織,摘取大鼠雙側腎臟,用生理鹽水沖洗干凈后,剔除腎被膜,取部分置于裝有4%多聚甲醛固定液的小離心管中進行固定,然后經脫水、透明、浸蠟、包埋等過程,制作成厚度為4 μm的切片,進行HE染色、Masson染色,光學顯微鏡下觀察。

1.5.4腎組織中mTOR、α-SMA、Col-Ⅰ陽性表達情況 采用免疫組化法檢測：取4%多聚甲醛固定的腎組織,石蠟切片脫蠟和水化,PBS洗3次,修復,3%的過氧化氫孵育15 min,PBS洗3次,血清封閉。滴加第一抗體(1∶100),復蘇35 min,PBS洗3次。滴加生物素化的二抗,37 ℃孵育30 min,PBS沖洗3次。滴加三抗 ,37 ℃孵育30 min,PBS洗3次,DAB 顯色,蘇木素復染,自來水沖洗,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。顯微鏡下圖像采集分析,染色結果呈棕黃色顆粒為陽性。使用Image J 軟件計算各張片子灰度值,以積分光密度與選擇范圍面積比值為最終平均光密度值。

1.5.5腎組織中mTOR、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達情況 采用Western blot法檢測：取200 mg液氮速凍后的冷凍腎組織,剪碎,加入RIPA組織裂解液2 mL,冰上充分裂解,4 ℃下12 000 r/min 離心15 min,轉移上清至新的離心管。BCA法計算出蛋白濃度。用30 μL 5×上樣緩沖液與120 μL蛋白樣本混合于200 μL的離心管中,于PCR儀上98 ℃煮沸5 min,冰浴5 min,重復3次,置于-80 ℃備用。經SDS-PAGE電泳,PVDF膜轉膜,取PVDF膜置于5%脫脂牛奶中,置于蛋白一抗稀釋液中,4 ℃慢搖,孵育過夜,BST洗膜,加入相應的二抗,室溫1 h,TBST洗膜,室溫5×6 min 搖洗。置于化學發光儀中曝光,使用Image J 軟件分析各條帶灰度值。

2 結 果

2.1各組大鼠ACR和24 h尿蛋白量比較 模型組ACR、24 h尿蛋白量均明顯高于空白組(P均<0.05);氯沙坦組和萆薢分清高、中劑量組ACR、24 h尿蛋白量均明顯低于模型組(P均<0.05),萆薢分清低劑量組ACR、24 h尿蛋白量與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 空白組和腎纖維化各組大鼠ACR和24 h尿蛋白量比較

2.2各組大鼠SCr和BUN水平比較 模型組SCr、BUN水平均明顯高于空白組(P均<0.05);氯沙坦組和萆薢分清高劑量組SCr水平及氯沙坦組和萆薢分清高、中劑量組BUN水平均明顯低于模型組(P均<0.05),萆薢分清中、低劑量組 SCr 水平和萆薢分清低劑量組 BUN水平與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 空白組和腎纖維化各組大鼠SCr和BUN水平比較

2.3各組大鼠腎組織病理形態 空白組大鼠腎小球、腎小管結構完整,偶見少量藍色膠原沉積;模型組大鼠腎小球結構破壞固縮,腎小管萎縮、結構破壞并伴有空泡變性,間質纖維細胞增生,可見大量藍色膠原沉積并可見炎性細胞浸潤;各給藥組大鼠病理損傷、纖維化程度較模型組輕,藍色膠原面積少。見圖1。

圖1 空白組和腎纖維化各組大鼠腎組織病理形態

2.4各組大鼠腎組織中mTOR、α-SMA、Col-Ⅰ陽性表達情況比較 模型組mTOR、α-SMA、Col-Ⅰ陽性表達平均光密度值均明顯高于空白組(P均<0.05);氯沙坦組和萆薢分清高、中劑量組mTOR、α-SMA陽性表達平均光密度值及各給藥組Col-Ⅰ陽性表達平均光密度值均明顯低于模型組(P均<0.05),萆薢分清低劑量組mTOR、α-SMA陽性表達平均光密度值與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖2及表3。

圖2 空白組和腎纖維化各組大鼠腎組織中mTOR、α-SMA、Col-Ⅰ陽性表達情況(免疫組化染色,×400)

表3 空白組和腎纖維化各組大鼠腎組織中mTOR、α-SMA、Col-Ⅰ陽性表達平均光密度值比較

2.5各組大鼠腎組織中mTOR、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達情況比較 模型組mTOR、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白相對表達量均明顯高于空白組(P均<0.05);各藥物組mTOR、Col-Ⅰ蛋白相對表達量及氯沙坦組和萆薢分清高、中劑量組α-SMA蛋白相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05),萆薢分清低劑量組α-SMA蛋白相對表達量與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3及表4。

圖3 空白組和腎纖維化各組大鼠腎組織中mTOR、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達情況

表4 空白組和腎纖維化各組大鼠腎組織中mTOR、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白相對表達量比較

3 討 論

腎纖維化是CKD進展到一定階段的必然病理變化,其發生發展機制至今尚未完全明確,為研究其機制,構建理想的疾病模型尤為重要。目前腎纖維化模型構建有藥物或毒物誘導、基因敲除、手術等多種方式,其中手術構建腎纖維化動物模型相對簡便、快捷,且能夠更好地模擬人類腎纖維化的進程,故目前多以手術構建腎纖維化模型為主[8]。單側輸尿管梗阻模型通過結扎單側輸尿管引起腎臟血流系統的阻塞,模擬臨床上常見的輸尿管梗阻導致的腎間質損傷,使腎臟血流動力學發生改變,腎血流量下降并呈進行性發展,腎實質受損,纖維化指標顯著增加,誘導ECM沉積,發生腎纖維化[9]。該模型操作步驟簡單,建模所需時間短,造模成功率高,模型可復制性強,是目前應用較為廣泛、較為理想的腎纖維化模型,故本實驗采用結扎單側輸尿管建立腎纖維化模型進行研究。

中醫學認為腎纖維化病機為本虛標實,本虛以肺脾腎三臟虧虛為主,邪實主要以水濕、濕熱、痰濁、瘀血、濁毒等病邪為主。導師馬鴻斌主任醫師在臨床診療過程中發現腎纖維化以腎虛濕熱兼瘀血證常見,在勤研經典、反復實踐的基礎上,以程鐘齡萆薢分清飲為底方,加減化裁為萆薢分清顆粒用以治療腎纖維化,此方補腎、清熱、利濕、活血并舉,標本兼顧。補腎以助腎行封藏之能,防止精微外泄,腎臟逐漸得以充養,腎體得充,則可恢復其主水液之用,蒸騰氣化則水液可正常敷布。如此既可補腎以固本,亦可清熱利濕活血以驅邪,扶正不斂邪,驅邪不傷正,以起到延緩腎纖維化進程的作用。且單味藥有效成分的研究證實,茯苓水提物可改善腎陽虛大鼠下焦水腫狀態,提高腎小球濾過率,改善大鼠腎功能[10];丹參有效成分丹參總酚酸可通過調控ZO-1、occludin等緊密連接蛋白的表達,從而改善慢性腎衰竭大鼠的腎功能,延緩腎纖維化進展[11];續斷多糖可擴張腎血管,改善血流狀態,降低血液黏稠度并改善脂質代謝,可明顯改善糖尿病腎病大鼠腎功能[12];黃果槲寄生有效提取物黃果槲寄生果實多糖可以提高受損傷免疫細胞的自我修復功能,從而增強環磷酰胺所致免疫低下小鼠的免疫功能,同時可增強機體抗氧化能力[13];甘草中活性物質甘草甜素可減輕阿霉素所致腎小球硬化大鼠腎小球系膜細胞增生程度,減少腎小管上皮細胞空泡變性,可通過抑制轉化生長因子-β1(TGF-β1)、結締組織生長因子(CTGF)等表達而減輕腎小球硬化[14]。王娟等[15]基于系統生物學和分子對接技術證實石菖蒲有效成分山柰酚可參與炎癥、凋亡、足細胞損傷、腎臟損傷等病理過程。

腎纖維化是在多種直接、間接因素的影響下,細胞周圍沉積大量基質成分而發生的。mTOR參與PI3K/Akt通路介導的上皮-間充質轉化(EMT),調節細胞生長、增殖及ECM沉積,在糖尿病和其他原因引起的CKD進展中發揮著重要作用[16]。其由mTORC1和mTORC2兩種主要的細胞內信號復合物組成,其中mTORC1刺激細胞生長和增殖,而mTORC2調節細胞極性和細胞骨架。mTOR過表達可刺激成纖維細胞增殖及其膠原合成,增加轉化生長因子-1(TGF-1)和結締組織生長因子等促纖維化細胞因子的表達,促進EMT[16-17];其表達下調可抑制EMT,從而減少肌成纖維細胞的轉化[18]。肌成纖維細胞在腎間質中的大量聚集和轉分化,是腎纖維化過程中ECM產生的重要方式,其中成纖維細胞主要分泌α-SMA、Col-Ⅰ,α-SMA、Col-Ⅰ是誘導ECM生成的主要因素,也是ECM的主要成分,在腎纖維化進程中起著關鍵作用[19-20]。因此抑制成纖維細胞的轉分化,減少成纖維細胞分泌α-SMA、Col-Ⅰ是治療腎纖維化的關鍵。

本實驗中,模型組大鼠ACR、24 h尿蛋白量、SCr水平、BUN水平和腎組織中mTOR、α-SMA、Col-Ⅰ陽性表達平均光密度值及蛋白相對表達量均明顯高壓空白組,腎臟發生明顯纖維化病變;與模型組比較,氯沙坦組與萆薢分清高、中劑量組大鼠ACR、24 h尿蛋白量、SCr水平、BUN水平和腎組織中mTOR、α-SMA、Col-Ⅰ陽性表達平均光密度值及蛋白相對表達量均明顯降低,腎纖維化病變較輕。表明萆薢分清顆?？擅黠@減輕單側輸尿管梗阻大鼠腎纖維化程度,保護殘存腎功能,其機制可能與下調腎纖維化相關蛋白mTOR、α-SMA、Col-Ⅰ的表達,從而減少ECM沉積有關。該結果為萆薢分清顆粒在腎纖維化防治中的應用提供了一定理論依據。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。