金銀花綠原酸對鋁致阿爾茨海默病模型小鼠相關分泌酶、脂氧素A4和生化指標的影響

農 嵩,黃佳鈴,黃翠娟,唐小棉,周維銘,俸翰超,韋翠萍,黃鷗飛,張樹球

(1. 右江民族醫學院,廣西 百色 533000;2. 廣西云球生物科技有限公司研究院, 廣西 百色 533000;3. 廣西百色清醒科技有限公司研究中心,廣西 百色 533000)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的發病機制復雜,β淀粉樣蛋白(Aβ)級聯學說是目前公認度最高的發病機制之一,該學說認為腦內Aβ聚集是AD患者的原發性改變,其他病理過程均由Aβ產生和清除的不平衡所致。其中β-分泌酶起到重要作用,抑制β-分泌酶可限制Aβ的產生,故尋找具有抑制β-分泌酶活性的物質對AD的防治具有重要意義[1]。鋁為一種慢性神經毒物,其會大量存在于腦神經纖維纏結(NFT)并引起AD[2]。目前AD臨床上尚無根治藥物,中醫中藥在治療AD方面由于不良反應少、成本低廉而日益受到重視。本研究采用超聲輔助醇提法提取金銀花中綠原酸,通過腹腔注射麥芽酚鋁溶液建立鋁中毒致AD小鼠模型,觀察了綠原酸對染毒小鼠學習記憶力和大腦相關分泌酶、脂氧素A4(LXA4)及血液生化指標的影響,以闡明中藥有效成分干預AD形成的機制,開發有效的抗AD新藥。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級小鼠70只(雌性38只,雄性32只),體重25～30 g,購自長沙市天勤生物技術有限公司,生產許可證號： SCXK(湘)2022-0011。放獨立式鼠籠飼養箱(廣東珠海市再鑫儀器有限公司)內飼養,每籠3～5只,編號,雌雄分開,自由飲用自來水,空氣過濾凈化,室溫空調26 ～ 28 ℃,適應環境7 d。通過實驗動物使用和倫理審查申請后進行實驗。

1.2藥品 將金銀花干品(市售,廣西百色市)在65 ℃恒溫烘箱中烘至恒重,粉碎后過30～120目篩,制備成風干樣品,按參考文獻[3]方法提取綠原酸,測定其含量為3.6 mg/mL。綠原酸標準品(上海原葉生物科技有限公司)。

1.3主要試劑與儀器 β-分泌酶、α-分泌酶、γ-分泌酶、LXA4、乙酰膽堿酯酶(AchE)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、血糖、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、總蛋白、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、肌酐(Cr)測試盒和結晶氯化鋁(AlCl3·6H2O)、氯化鈉、麥芽酚、無水乙醇(分析純)、生理鹽水(廣西南寧市聚源儀器儀表有限責任公司),pH7.4的0.01 mol/L磷酸緩沖液(PBS); SpectraMax M5型酶標儀、Y型水迷宮刺激器、UV-5500型紫外可見分光光度計(上海元析科學儀器有限公司),FB224型電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司),FZ102型植物粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司),N-1100S-WD型旋轉蒸發儀(日本東京理化),SM900A型超聲波細胞粉碎機(南京舜瑪儀器設備有限公司),DS-5510DTH型超聲波清洗機(上海生析超聲儀器有限公司),Master touch 602型超純水儀(上海和泰),DGT-G135S型電熱鼓風干燥箱(合肥達斯卡特生物科技有限公司),TG16-WS型高速臺式離心機(湖南湘儀),HH-42型數顯式電熱恒溫水溫箱(上海躍進)。

1.4分組、造模及干預 將小鼠隨機分為正常組,模型組及金銀花綠原酸低、中、高劑量組,每組14只。除正常組外,其余組小鼠均給予麥芽酚鋁溶液(將等體積的麥芽酚溶液和三氯化鋁溶液混合,調pH至7.1～7.4,抽濾后使用)0.8 mg/(kg·d)腹腔注射染毒,每連續注射5 d間歇2 d,共染毒8周。從染毒第5周開始,金銀花綠原酸低、中、高劑量組分別給予金銀花綠原酸溶液40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg(按金銀花提取綠原酸含量3.6 mg/mL換算給藥量)灌胃,正常組和模型組灌喂等體積蒸餾水,均1次/d,直至實驗結束。實驗過程中,所有小鼠飼以普通飼料,自由飲水和進食,自然晝夜節律光照,籠具、飲水瓶等用具均不使用含鋁制品;每天觀察記錄小鼠行為及糞便、脫毛、進食、消瘦、死亡等情況。

1.5檢測指標及方法

1.5.1學習記憶能力 實驗結束后,參照文獻[4]方法,采用Y型水迷宮刺激器檢測各組小鼠的學習記憶能力,記錄各組小鼠達到學會標準時所需的測試次數、20次測試中的記憶錯誤次數和錯誤率。

1.5.2腦組織中相關分泌酶和LXA4含量 水迷宮實驗結束后處死各組小鼠,取大腦組織,置于-20 ℃冰箱冷凍貯存待用,臨用前以0.01 mol/L的PBS清洗腦組織表面血跡,濾紙吸干,稱重,在冰浴下用玻璃勻漿器研磨10 min,以PBS制成10%腦勻漿,取上清貯存于-20 ℃冰箱。按照酶聯免疫吸附測定試劑盒說明步驟,測定勻漿中 β-分泌酶、α-分泌酶、γ-分泌酶、LXA4和AchE含量。每個樣品設立相應復孔,所有樣品的測試結果都在標準曲線范圍內。

1.5.3血清生化指標 實驗結束處死前各組小鼠從眼球取血,分離血清, 按試劑盒說明書操作步驟檢測血糖、TC、TG、HDL-C、總蛋白、ALT、BUN、Cr、UA水平。

2 結 果

2.1各組小鼠存活情況及狀態 實驗結束后,正常組13只、模型組11只、綠原酸低劑量組12只、綠原酸中劑量組11只、綠原酸高劑量組12只小鼠存活,模型組小鼠相對消瘦、行動遲緩,其余各組無異常臨床表現。

2.2各組小鼠的學習和記憶情況 模型組小鼠學習測試次數、記憶錯誤次數和錯誤率均明顯高于正常組(P均<0.05),金銀花綠原酸各組小鼠學習測試次數、記憶錯誤次數和錯誤率均明顯低于模型組(P均<0.05),綠原酸高劑量組小鼠學習測試次數、記憶錯誤次數均明顯低于綠原酸低劑量組(P均<0.05),綠原酸各劑量組錯誤率比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 正常組和阿爾茨海默病各組小鼠學習和記憶測試結果比較

2.3各組小鼠腦組織中β-分泌酶、α-分泌酶、γ-分泌酶、LXA4、AchE含量比較 模型組和金銀花綠原酸各組β-分泌酶含量均明顯高于正常組(P均<0.05),金銀花綠原酸各組均明顯低于模型組(P均<0.05);各組α-分泌酶含量比較差異均無統計學意義(P均>0.05);模型組γ-分泌酶、AchE含量均明顯高于正常組(P均<0.05),金銀花綠原酸各組γ-分泌酶、AchE含量均明顯低于模型組(P均<0.05);模型組和金銀花綠原酸低、中劑量組LXA4含量均明顯低于正常組(P均<0.05),金銀花綠原酸高劑量組明顯高于模型組(P<0.05);金銀花綠原酸各組β-分泌酶、γ-分泌酶、LXA4、AchE含量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 正常組和阿爾茨海默病各組小鼠腦組織中β-分泌酶、α-分泌酶、γ-分泌酶、LXA4、AchE含量比較

2.4各組小鼠血清生化指標水平比較 模型組血糖、TC、TG、ALT、BUN、Cr、UA水平和金銀花綠原酸低、中劑量組TC、TG、BUN水平均明顯高于正常組(P均<0.05),模型組HDL-C水平和金銀花綠原酸中、高劑量組UA水平均明顯低于正常組(P均<0.05)。金銀花綠原酸各組血糖、ALT、BUN、UA水平和金銀花綠原酸中、高劑量組TC、Cr水平及金銀花綠原酸高劑量組TG水平均明顯低于模型組(P均<0.05),金銀花綠原酸中、高劑量組HDL-C水平和金銀花綠原酸高劑組總蛋白水平均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表3。

表3 正常組和阿爾茨海默病各組小鼠血清各生化指標水平比較

3 討 論

生理情況下,腦內神經元胞體分泌的β淀粉樣前體蛋白(APP)由α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶對其裂解,α-分泌酶在APP的Aβ結構域內進行水解,產物為對神經元具有保護作用的sAPPα,而β-分泌酶和γ-分泌酶協同裂解則產生Aβ1-40和Aβ1-42,Aβ1-40和Aβ1-42是構成老年斑(SP)的主要成分。根據β淀粉樣蛋白級聯學說,Aβ的形成和轉化在AD發病分子機制中處于中心位置,Aβ是各種原因誘導AD的共同通路,是AD形成和轉化的關鍵因素[5-6]。目前抑制β-分泌酶或減少Aβ的產生是防治AD的主要研究方向。LXA4是一種內源性的抗炎分子,具有抑制AD進展的活性,并能改善AD[7-8]。腦AchE含量與腦組織損傷密切相關,其含量升高說明腦組織由于受到損傷而通過神經再生對腦組織進行損傷修復,但大量的AchE可導致行動遲緩,可能也是導致學習記憶能力發生障礙的原因之一[9]。

金銀花即忍冬,課題組前期研究發現金銀花可減輕AD模型小鼠腦組織病理變化[10],可通過降低Aβ1-42,避免tau蛋白過度磷酸化及總tau蛋白含量異常增加[2],具有干預鋁暴露致AD的作用,且對心臟鋁有一定的促排作用[11]。其具有促進重金屬排泄的作用可能與中藥植物中的有機酸與重金屬離子絡合而加速其排泄有關[12]。綠原酸是金銀花主要的有效成分,是植物細胞在有氧呼吸過程中經草莽酸途徑產生的一種苯丙素類物質,其含量是衡量金銀花品質的重要指標。近年來綠原酸作為國際公認的植物黃金引起了廣泛關注,其具有較強的生物學活性,如抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗氧化、降血糖、拮抗鋁神經毒性等[13]。金銀花綠原酸是酚型抗氧化劑[14],可通過提高抗氧化能力來抑制Aβ誘導的海馬神經元凋亡、線粒體損傷和細胞內質網應狀態,保護神經功能[15];還可通過提高機體抗氧化能力,降低海馬APP、Aβ1-42、磷酸化tau蛋白表達而改善AD小鼠的認知功能[16]。張馨予[17]研究發現,綠原酸可通過螯合和抗氧化作用減輕鋁暴露誘導的細胞毒性,并可通過調節Akt/GSK-3β信號通路減少鋁暴露誘導的Aβ1-42的產生從而發揮神經保護作用。

研究表明,亞慢性鋁暴露可以引起小鼠大腦皮質的表達增加,可造成Aβ生成增多,或通過間接的途徑對神經產生毒性,使神經元變性死亡,從而引起不可逆的學習記憶及認知功能障礙[18]。麥芽酚是鋁的良好配體,與鋁有高度親和力,故本實驗采用麥芽酚鋁作為染毒劑建立AD動物模型,該方法建立的模型是較理想的鋁中毒模型。本實驗結果顯示,模型組小鼠的記憶能力和腦組織中LXA4含量明顯低于正常組,腦組織中β-分泌酶、γ-分泌酶、AchE含量明顯高于正常組,血糖、血脂、尿酸、肝腎功能指標出現異常;與模型組比較,金銀花綠原酸各組記憶能力和金銀花綠原酸高劑量組腦組織中LXA4含量明顯升高,腦組織中β-分泌酶、γ-分泌酶、AchE含量明顯降低,且β-分泌酶、γ-分泌酶含量能恢復至與正常組相當的水平,血糖、血脂、尿酸、肝腎功能指標均明顯改善。由此推測金銀花綠原酸改善鋁染毒致AD小鼠學習記憶能力障礙的機制可能是通過調控相關分泌酶、LXA4和各生化指標而實現的。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。