基于cGAS-STING通路探討參白扶正顆粒調節腫瘤免疫應答的作用機制

劉福蓉,李 奕,黃 進,溫 婷,陳方姍

(西南醫科大學附屬中醫醫院,四川 瀘州 646000)

胃癌是臨床常見惡性消化道腫瘤,據最新腫瘤發病率統計,我國每年新發胃癌近70萬例,死亡近50萬例,發病率、病死率高居因癌癥死亡中第2位,目前對該病的治療尚無突破性進展[1-2]。參白扶正顆粒是西南醫科大學附屬中醫醫院的臨床經驗方,具有扶正祛瘀、補肝健脾、益氣散結的功效,臨床用于乳腺癌的治療可減輕癥狀,提高機體免疫功能[3]。臨床用于胃癌的治療發現其可減輕化療不良反應,對預防胃癌轉移也有積極作用,但具體作用機制尚不明確。鳥苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS)是一種能激活干擾素基因刺激因子(STING)蛋白的細胞質DNA傳感器,對于DNA病原體產生保護性免疫防御,cGAS-STING通路在抵御病原體入侵、腫瘤免疫中發揮關鍵作用[4-5],激活該通路可促進自然殺傷細胞浸潤,抑制癌細胞增殖和免疫逃逸[6-8]?；诖?本研究建立胃癌移植瘤小鼠模型,探討了參白扶正顆粒能否通過cGAS-STING通路介導腫瘤免疫應答而抑制胃癌的發展,以為其臨床應用提供理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級KM小鼠60只,體重(20±2)g,由四川省人民醫院實驗動物研究所提供,動物生產許可證號：SCXK(川)2018-15,于室內溫度21～25 ℃,相對濕度45%～55%條件下標準鼠飼料及無菌水飼養。本實驗已取得西南醫科大學實驗動物管理委員會批準(倫理編號：SWMU20230011),所涉及的研究方案符合中國倫理委員會關于實驗動物的指導原則。

1.2實驗藥物及細胞株 參白扶正顆粒由黨參、黃芪、當歸、澤瀉、決明子、細辛、熟地黃、鹿角、菟絲子、枸杞子、天麻組成,由西南醫科大學附屬中醫醫院制劑室生產,川藥制字Z20080290,規格：10 g/袋,制成含5 mg/mL的藥液備用。MGC-803人胃癌細胞(澳睿賽生物,貨號：ORC0554)。

1.3主要試劑與儀器 4%多聚甲醛溶液、磷酸緩沖液、乙醇、二甲苯(湖北鑫鳴泰化學有限公司),蘇木素液、伊紅液(南京科佰生物科技有限公司),免疫活化指標[CD4+、CD8+、γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、CD45+CD11c+MHC-Ⅱ+、CD40+、CD70+、CD4+Foxp3+Treg]抗體(美國MP Biomedicals生物醫學公司),β干擾素(IFN-β)、C-C類趨化因子22(CCL22)、C-C類趨化因子17(CCL17)、白細胞介素-10(IL-10)試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司),RIPA裂解液(美國Sigma-Aldrich公司),STING、TANK結合激酶1(TBK1)、干擾素調節因子 3(IRF3)兔單克隆抗體和GAPDH兔單克隆抗體(英國abcam公司),電子天平、石蠟包埋機、石蠟切片機(德國Leica公司),光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司),組織超聲勻漿機、流式細胞儀(美國BD公司),凝膠成像分析系統(以色列DNR成像系統有限公司)。

1.4造模及干預方法 體外培養人胃癌MGC-803細胞,消化細胞后進行離心,PBS調節細胞濃度至1.0×107個/mL,按0.2 mL/只接種于小鼠左側腋下,建立人胃癌MGC803細胞裸鼠移植瘤模型。將42只造模成功小鼠按照隨機數字表法分為模型組、參白扶正低劑量組、參白扶正中劑量組、參白扶正高劑量組,根據人的參白扶正顆粒用藥劑量為40 g/70 kg以及人和動物間按體表面積折算的等效劑量換算,參白扶正低、中、高劑量組小鼠分別給予參白扶正顆粒5 mg/g、10 mg/g、20 mg/g灌胃,模型組給予等量生理鹽水灌胃,均2次/d,連續灌胃15 d。

1.5檢測指標及方法

1.5.1瘤重和腫瘤抑制率 末次灌胃24 h后脫頸處死小鼠,剝離瘤體組織,稱重并計算腫瘤抑制率[(1-給藥組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100%]。

1.5.2腫瘤組織病理形態 末次灌胃24 h后脫頸處死小鼠后取新鮮腫瘤組織,采用磷酸緩沖液沖洗,依次進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋,制成約4 μm厚度石蠟切片,再依次進行脫蠟、水化、蘇木素染色、伊紅染色、脫水封片,晾干后于光學顯微鏡下觀察。

1.5.3腫瘤組織中免疫活化指標水平 取新鮮腫瘤組織,制成單細胞懸液,取出100 μL腫瘤組織浸潤淋巴細胞懸液4份并標號,1號標本加入CD4+-RPE抗體、CD8+-RPE抗體、IFN-γ-RPE抗體、TNF-α-RPE抗體;2號標本加入CD45+-FITC抗體、CD11c+-FITC抗體、MHC-Ⅱ+-FITC抗體;3號標本加入CD40+-FITC抗體、CD70+-FITC抗體;4號標本中加入CD4+-RPE抗體,4 ℃孵育15 min后加入Foxp3抗體。1～4號標本添加完抗體后進行避光操作,并于4 ℃的溫度下孵育20 min,孵育完成后加入500 μL RBC裂解液,室溫避光孵育30 min,上流式細胞儀檢測CD4+、CD8+、IFN-γ、TNF-α、CD45+CD11c+MHC-Ⅱ+、CD40+、CD70+及CD4+Foxp3+Treg水平。

1.5.4腫瘤組織中cGAS-STING通路相關細胞因子水平 取新鮮腫瘤組織,磷酸緩沖液沖洗后機械剪碎勻漿,在離心半徑12.5 cm、10 000 r/min條件下離心15 min,分離上清液,嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測IFN-β、CCL22、CCL17、IL-10水平。

1.5.5腫瘤組織中cGAS-STING通路相關蛋白表達情況 取新鮮腫瘤組織,加入RIPA裂解液,勻漿后提取總蛋白,BCA法測量蛋白含量。取30 μg蛋白,依次進行凝膠電泳、轉膜、封閉后,加入一抗STING、TBK1、IRF3和GAPDH(稀釋比例均為1∶1 000),4 ℃過夜,次日洗膜后加入二抗(稀釋比例均為1∶10 000),恒溫搖床1 h,滴加ECL,凝膠成像系統分析,采用Image J軟件計算條帶灰度值。

2 結 果

2.1各組小鼠瘤重、腫瘤抑制率比較 參白扶正各組瘤重均明顯低于模型組(P均<0.05),且瘤重隨參白扶正顆粒劑量增加而降低,腫瘤抑制率隨參白扶正顆粒劑量增加而升高,兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 胃癌移植瘤各組小鼠瘤重及腫瘤抑制率比較

2.2各組小鼠腫瘤組織病理形態 模型組胃癌移植瘤小鼠胃黏膜組織細胞排列不規整且異型性明顯,細胞間質充血水腫且有明顯炎癥浸潤;參白扶正各組胃癌移植瘤小鼠胃黏膜炎癥浸潤和細胞間質充血水腫較模型組不同程度減輕,細胞排列相對整齊,異型性不明顯,其中參白扶正高劑量組改善最明顯。見圖1。

圖1 胃癌移植瘤各組小鼠腫瘤組織病理形態(HE染色,×200)

2.3各組小鼠腫瘤組織中免疫活化指標水平比較參白扶正各組CD4+、CD8+、IFN-γ、CD45+CD11c+MHC-Ⅱ+、CD40+、CD70+水平均明顯高于模型組,TNF-α、CD4+Foxp3+Treg水平均明顯低于模型組,且CD4+、CD8+、IFN-γ、CD45+CD11c+MHC-Ⅱ+、CD40+、CD70+水平隨參白扶正顆粒劑量增加而升高, TNF-α、CD4+Foxp3+Treg水平隨參白扶正顆粒劑量增加而降低,兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 胃癌移植瘤各組小鼠腫瘤組織中免疫活化指標水平比較

2.4各組小鼠腫瘤組織中IFN-β、CCL22、CCL17、IL-10水平比較 參白扶正各組IFN-β、CCL22、CCL17、IL-10水平均明顯低于模型組,且各指標水平隨參白扶正顆粒劑量增加而降低,兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表3。

表3 胃癌移植瘤各組小鼠腫瘤組織中cGAS-STING通路相關細胞因子水平比較

2.5各組小鼠腫瘤組織中cGAS、STING、TBK1、IRF3蛋白表達情況比較 參白扶正各組cGAS、STING、TBK1、IRF3蛋白相對表達量均明顯高于模型組,且各蛋白相對表達量隨參白扶正顆粒劑量增加而升高,兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見圖2及表4。

表4 胃癌移植瘤各組小鼠腫瘤組織中cGAS-STING通路相關蛋白相對表達量比較

3 討 論

目前胃癌以手術、放化療等綜合治療為主,但長期放化療產生的不良反應較大,加之部分患者耐受性較差,胃癌患者預后仍不理想。近年來中醫藥因其多靶點、不良反應少等特點在胃癌領域逐漸受到重視。參白扶正顆粒中黨參多糖、黃芪甲苷等有效成分不僅可提高機體細胞免疫功能,而且具有抗炎、抑制腫瘤細胞增殖的作用[9-10]。本實驗結果顯示,胃癌移植瘤小鼠瘤重隨參白扶正顆粒劑量增加而明顯降低,腫瘤抑制率隨參白扶正顆粒劑量增加而明顯升高,胃黏膜炎癥浸潤和細胞間質充血水腫較模型組不同程度減輕,由此可見參白扶正顆?？梢种莆赴┮浦擦鲂∈竽[瘤生長。

免疫功能在惡性腫瘤發生發展中具有重要作用。T淋巴細胞是一類腫瘤浸潤性且具有抗原效應的細胞群,以CD4+、CD8+為主,IFN-γ是CD4+分化出的Th1細胞分泌的因子,可呈遞抗原,誘導CD8+、巨噬細胞活化,調節免疫應答;TNF-α是CD4+分化出的Th2細胞分泌的免疫抑制因子,可促使巨噬細胞發生極化,抑制免疫;CD8+為細胞毒性T細胞,可直接殺傷腫瘤細胞而發揮抗腫瘤作用[11-13]。樹突狀細胞屬于特異性抗原提呈細胞,在誘導免疫應答、調控T細胞免疫中發揮重要作用,其中CD45+CD11c+MHC-Ⅱ+、CD40+、CD70+是樹突細胞成熟、活化的標志物,這些指標水平升高意味著樹突細胞增多,可為T細胞活化提供更多抗原信息,繼而抑制腫瘤細胞增殖、分化[14]。CD4+Foxp3+Treg是近年來發現的具有免疫抑制作用的T細胞亞群,可逆向調控CD4+、CD8+細胞,其水平降低可促進CD4+、CD8+細胞活化、增殖,從而增強機體抗腫瘤免疫應答反應[15]。本實驗結果顯示,參白扶正各組腫瘤組織中CD4+、CD8+、IFN-γ、CD45+CD11c+MHC-Ⅱ+、CD40+、CD70+水平均明顯高于模型組,TNF-α、CD4+Foxp3+Treg水平均明顯低于模型組,提示參白扶正顆?？烧{節胃癌移植瘤小鼠免疫功能。

cGAS-STING通路與惡性腫瘤的發生密切相關,其在腫瘤細胞、非腫瘤細胞中均可被激活,誘導一系列干擾素、細胞因子表達[16]。IFN-β作為一種干擾素,與免疫系統有著密切的關系,其不僅能夠增強機體的免疫應答能力,刺激免疫細胞產生更多的免疫活性物質,從而抵御病原體的侵襲,還能夠通過調節腫瘤細胞的基因表達,抑制腫瘤細胞增殖和轉移,從而起到抗腫瘤的作用。IFN-β水平降低意味著DAPK3感知STING的能力減弱,免疫逃逸受到抑制[17]。CCL22、CCL17是趨化因子家族重要成員,與腫瘤細胞特異性受體結合后可誘導腫瘤細胞遷移、侵襲,二者表達水平降低提示腫瘤侵襲能力降低[18];IL-10是由T細胞分泌的促炎因子,直接參與樹突狀細胞誘導的腫瘤免疫耐受,因此當IL-10水平降低時,則提示腫瘤免疫應答增強[19]。本研究發現參白扶正各組IFN-β、CCL22、CCL17、IL-10水平均低于模型組,提示參白扶正顆?？烧{控胃癌移植瘤小鼠腫瘤免疫應答,抑制免疫逃逸。

STING蛋白表達對自發性T細胞激活、自然殺傷細胞活力、T細胞殺傷效應有明顯影響,其與2’3’-環GMP-AMP二核苷酸結合后形成的多聚體可在高爾基體上招募激酶TBK1,激酶TBK1可使STING磷酸化,而STING磷酸化又可介導IRF3磷酸化,進一步刺激DNA依賴性樹突狀細胞活化,吞噬腫瘤微環境中的壞死細胞,發揮抗腫瘤效應[20-21]。而cGAS能夠識別并結合雙鏈DNA,之后cGAS會催化細胞質中的ATP和GTP,合成第二信使cGAMP,cGAMP與STING結合后,會使STING從內質網轉移到高爾基體,從而激活下游的信號通路,cGAS通過上述過程,啟動了機體的先天免疫反應[21]。本研究發現參白扶正各組STING、TBK1、IRF3蛋白表達量均上調,提示參白扶正顆?？烧{控cGAS-STING通路。

綜上所述,參白扶正顆?？稍鰪娢赴┮浦擦鲂∈竺庖吖δ?調節腫瘤免疫應答,其機制可能與調控cGAS-STING通路有關。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。