LncRNA MIR503HG靶向miR-32-5p調控 ITGA6表達對非小細胞肺癌增殖與遷移的影響

姜丹丹 羅喜鋼

(1錦州醫科大學,遼寧 錦州 121001;2錦州醫科大學附屬第三醫院檢驗科)

近年來,高發病率及高致死率的肺癌成為眾多研究學者的研究熱點之一。依據組織形態學特性,肺癌被分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC),而NSCLC的發病率在80%～85%。由于疾病缺乏實時監測手段,大多數患者依靠手術切除與放化療相結合的干預方案來緩解癥狀,極易影響患者的生活和生存質量〔1〕。因此,更進一步闡明NSCLC細胞的增殖與轉移的分子機制,推動個體化靶向治療的開展,具有重大臨床意義。大量證據顯示〔2〕長鏈非編碼RNA(LncRNAs)及微小RNA(miRNAs)通過與靶基因、蛋白的相互作用參與腫瘤細胞的增殖、分化、轉移與侵襲等過程。LncRNAs及miRNAs表達的異常直接影響腫瘤的發生、發展及惡性轉移、化學耐藥等進展。LncRNA MIR503HG位于人類基因組X染色體的134543377～134546630區域,是miR-503的宿主基因。Hu等〔3〕研究顯示LncRNA MIR503HG在宮頸癌組織中的表達升高,并且高表達的LncRNA MIR503HG直接增強了癌細胞的體外增殖與侵襲能力。miR-32-5p位于人染色體9q31.3上,該區段的基因主要在基因擴增及蛋白修飾方面發揮作用。Yang等〔4〕研究顯示miR-32-5p的表達在三陰性乳腺癌中明顯降低,轉染miR-32-5p mimic之后,細胞中波形蛋白(Vimentin)表達明顯降低,E-鈣黏蛋白(cadherin)表達明顯升高,細胞的生長明顯受限,誘導其趨于凋亡。但是有關LncRNA MIR503HG和miR-32-5p在NSCLC作用的報道較少。Li等〔5〕研究顯示整合素α(ITGA)6在肺腺癌細胞的淋巴轉移中發揮關鍵作用,是治療肺腺癌淋巴轉移最具潛力的治療靶點,但是并未詳細闡明ITGA6對腫瘤細胞的作用機制。本研究主要探討LncRNA MIR503HG、miR-32-5p、ITGA6在NSCLC中的表達及其對NSCLC細胞增殖與轉移的影響。

1 材料和方法

1.1在線分析信息〔6〕從癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫中提取273例NSCLC患者癌組織及其對應癌旁組織的LncRNA、miRNA及轉錄組mRNA的芯片數據,R軟件中MAX STAT 函數包統計分析LncRNA MIR503HG、miR-32-5p、ITGA6在NSCLC中的表達情況。并通過GEPIA分析LncRNA MIR503HG、ITGA6對NSCLC患者預后的影響,通過UALCAN數據庫(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析miR-32-5p對NSCLC患者預后的影響。

1.2NSCLC組織臨床樣本信息 選取2018年2月至2021年8月錦州醫科大學附屬第三醫院手術切除的80例NSCLC患者的癌組織,平均年齡(47.65±18.93)歲,所有入選患者經病理切片確診為NSCLC,均為原發性肺癌,并未經放化療干預,入選患者的其他器官或組織未罹患惡性腫瘤、免疫缺陷等疾病,患者的病理資料均完整,同時收集遠離病灶位置2 cm以上的癌旁組織。入選患者均已簽署知情同意書,并且本研究經醫院倫理委員審核批準。所有樣本4%多聚甲醛常規固定,用于聚合酶鏈反應(PCR)檢測。

1.3實驗材料 人永生化支氣管上皮細胞系BEAS-2B、NSCLC細胞系A549,PC9,H1975,H460,SK-MES-1,H1299購自廣州賽庫生物科技有限公司(中國廣州)。LncRNA MIR503HG-mimic和LncRNA MIR503HG-mimic-NC,miR-32-5p-agomir和miR-32-5p-agomir-NC及pcDNA3.1-ITGA6由華強基因編輯技術(沈陽)有限公司提供。實驗動物品系:BALB/c雄性裸鼠;清潔級別:SPF級;周齡:6～8周齡;體質量(20±2)g,50只,購自錦州醫科大學,動物生產許可證號:SCXK(遼)2019-0003;實驗動物適應性喂養1 w后開展實驗,本研究已獲取錦州醫科大學附屬第三醫院倫理委員會的批準。實驗試劑:兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、Vimentin、E-cadherin及ITGA6抗體(美國Thermo公司),逆轉錄試劑盒、擴增試劑盒、RNA提取試劑盒購自(日本TaKaRa公司),滅活的胎牛血清(FBS)、多聚甲醛(江蘇萬邦醫藥集團有限公司),細胞裂解液、胰酶消化液、中性樹脂(天津凱信化學工業有限公司),化學發光試劑、熒光劑Luciferin、磷酸鹽緩沖液(PBS,江蘇恩莫阿賽生物技術科技公司),Western印跡試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(天津利安隆博華生物技術有限公司),Transwell小室、雙熒光素酶試劑盒、杜爾伯科改良伊格爾培養基(DMEM)培養基、5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EDU)增殖試劑盒(成都科龍生物技術有限公司)。

實驗儀器:組織研磨器(杭州奧盛科技有限公司),恒溫培養箱(寧波新芝生物儀器有限公司),瓊脂糖電泳儀及全自動凝膠成像分析系統(天能科技有限公司),CFX96熒光定量反轉錄(qRT-PCR)擴增儀(美國Bio-Rad公司),微量注射器(丹麥 Labogene 公司),光學顯微鏡(日本Olympus公司)

1.4qRT-PCR實驗 Trizol法分別提取臨床癌組織和細胞系的總RNA,在確定完整性和濃度后〔7〕,按逆轉錄試劑盒要求合成cDNA,PCR儀擴增目的基因。通過2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量?；蛐蛄袨?5′-3′):LncRNA MIR503HGG上游引物:GTGACAGATGGGCTCTGCTT,下游:AAGGGCCAGTAG-TTGGAAGT;miR-32-5p上游引物:AGCTGCCCACTTGGTGAACGC,下游:TCAGGCCCGGAACAGTTGTGA;ITGA6上游引物:CCACCCCAAATACAAGACGGA,下游:CAGGTCTTCGCTAGGGTTGT;GAPDH上游引物:TGAAGGTCGGAGTCAACGG,下游:CCTGGAAGATGGTGATGGG。

1.5雙熒光素酶實驗 生物信息數據庫預測LncRNA MIR503HG、miR-32-5p、ITGA6之間的作用位點,之后按照雙熒光素酶試劑盒要求構建野生型與突變型質粒,依次與H1299細胞進行共轉染,37 ℃,5%CO2條件下培養48 h后,檢測酶活性。

1.6細胞的分組處理 取對數生長期的H1299細胞進行實驗,分組轉染操作如下:LncRNA-mimic-NC組細胞轉染LncRNA MIR503HG-mimic-NC,常規培養;LncRNA-mimic組細胞轉染LncRNA MIR503HG-mimic,常規培養;agomir-NC組細胞常溫下轉染miR-32-5p-agomir-NC,常規培養;agomir組細胞常溫下轉染miR-32-5p-agomir,常規培養;Lnc-mimic+agomir組細胞轉染LncRNA MIR503HG-mimic+miR-32-5p-agomir,常規培養;Lnc-mimic+agomir+pc組細胞轉染LncRNA MIR503HG-mimic+miR-32-5p-agomir+pcDNA3.1-ITGA6,常規培養;agomir+pc組細胞常溫下轉染miR-32-5p-agomir+pcDNA3.1-ITGA6,常規培養;另取不進行任何轉染的細胞常規培養作為Normal組。

1.7EDU染色實驗 調整對數生長期的H1299細胞的濃度至1×105個/孔并接種在24孔板上,分組同1.6,空氣濕度95%,5%CO2,37 ℃條件下培養24 h,收集各組細胞,PBS漂洗3次,每次3 min,每孔加入100 μl的EDU染色液,避光孵育,熒光顯微鏡觀察,ImageJ軟件進行統計分析。

1.8Transwell小室實驗 各組細胞分組同1.6,將H1299細胞以1×106個/ml接種在已預先鋪好基質膠的Transwell小室上室中,培養24 h,室溫下,結晶紫避光染色,孵育30 min,鏡檢。

1.9裸鼠皮下種植NSCLC實驗 將50只實驗動物按隨機數字表法分為5組:Normal組、LncRNA-mimic-NC組、LncRNA-mimic組、mimic+agomir組、mimic+agomir+pc組,每組10只。各組細胞分組處理同1.6,常規培養24 h,重懸細胞,將各組細胞分別注射至對應組的裸鼠體內,同時腹腔注射熒光劑,無菌操作臺上,顯微鏡下,連接活體小動物成像系統(VIS)。常規喂養裸鼠4 w后,斷頭處死,取出各組動物皮下組織中的腫瘤塊,待測。

1.10Western印跡實驗 放射免疫沉淀試驗(RIPA)法裂解細胞,離心后,BCA法測定上清液中的蛋白濃度,以50 μg進行電泳分離,濕法轉膜后,封閉,加入一抗(ITGA6、Vimentin、E-cadherin、GAPDH的稀釋比例均為1∶500),4 ℃避光孵育24 h,磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗,加入二抗(1∶1 500),孵育,ImageJ軟件統計分析〔8〕各條帶灰度值。

1.11統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗及Spearman相關分析,制圖采用軟件Graphpad8.1。

2 結 果

2.1臨床腫瘤組織中LncRNA MIR503HG和miR-32-5p表達 與癌旁組織相比,NSCLC腫瘤組織中LncRNA MIR503HG、ITGA6 mRNA水平明顯增加,miR-32-5p mRNA水平明顯下降(均P<0.05);經GEPIA數據庫分析顯示,與LncRNA MIR503HG高表達的NSCLC患者相比,LncRNA MIR503HG低表達患者的生存曲線明顯升高(P<0.05);經UALCAN數據庫分析,與miR-32-5p高表達的NSCLC患者相比,miR-32-5p低表達患者的生存曲線明顯降低(P<0.05);Spearman相關性分析結果顯示,LncRNA MIR503HG與miR-32-5p在NSCLC癌組織組織中的表達呈明顯負相關(P=0.000)。見圖1、表1。

圖1 在線分析LncRNA MIR503HG和miR-32-5p對NSCLC患者生存期的影響及二者表達的相關性

2.2NSCLC肺癌細胞系中LncRNA MIR503HG、miR-32-5p及ITGA6 mRNA表達 與BEAS-2B細胞相比,LncRNA MIR503HG、ITGA6 mRNA在NSCLC細胞系A549,PC9,H1975,H460,SK-MES-1,H1299中表達水平明顯增加,miR-32-5p mRNA表達水平明顯下降(均P<0.05),而H1299細胞中LncRNA MIR503HG、miR-32-5p、ITGA6 mRNA表達與BEAS-2B細胞中差異最明顯,后續細胞實驗均使用H1299細胞。見表1。

表1 臨床樣本及細胞系中LncRNA MIR503HG、miR-32-5p和ITGA6 mRNA相對表達比較

2.3雙熒光素酶實驗 ENCORI數據庫顯示LncRNA MIR503HG和miR-32-5p存在互補位點,見圖2。雙熒光素酶實驗結果顯示,以LncRNA MIR503HG mimic過表達LncRNA MIR503HG后,miR-32-5p(野生型)熒光素酶活性明顯下降(P<0.05),miR-32-5p(突變型)熒光素酶活性無明顯差異(P>0.05),說明在NSCLC中,LncRNA MIR503HG可靶向調控miR-32-5p表達。見表2。

圖2 LncRNA MIR503HG與miR-32-5p的特異性結合位點

表2 雙熒光素酶結果

2.4LncRNA MIR503HG通過miR-32-5p表達影響H1299細胞體外增殖與遷移能力 EDU染色實驗結果顯示,與Normal組相比,LncRNA-mimic組、Lnc-mimic+agomir組能明顯升高EDU陽性細胞比例(P<0.05);與LncRNA-mimic組相比,Lnc-mimic+agomir組EDU陽性細胞比例明顯降低(P<0.05)。Transwell小室實驗結果顯示,與Normal組相比,LncRNA-mimic組、Lnc-mimic+agomir組遷移細胞數量明顯升高(P<0.05);與LncRNA-mimic組相比,Lnc-mimic+agomir組遷移細胞數量明顯降低(P<0.05)。Western印跡實驗結果顯示,與Normal組相比,LncRNA-mimic組、Lnc-mimic+agomir組ITGA6、Vimentin表達水平明顯升高,E-cadherin表達水平明顯降低(P<0.05);與LncRNA-mimic組相比,Lnc-mimic+agomir組ITGA6、Vimentin表達水平明顯降低,E-cadherin表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖3、表3、圖4。

圖3 LncRNA MIR503HG通過調控miR-32-5p的表達影響H1299細胞的體外增殖與遷移

表3 LncRNA MIR503HG調控miR-32-5p對H1299細胞ITGA6、Vimentin、E-cadherin表達的影響

1～4:Normal組,LncRNA-mimic-NC組,LncRNA-mimic組,Lnc-mimic+agomir組

2.5ITGA6在NSCLC癌中表達 經GEPIA數據庫分析顯示,與ITGA6高表達的NSCLC患者相比,ITGA6低表達患者的生存曲線明顯升高(P<0.05),見圖5;Spearman相關性分析結果顯示,NSCLC癌組織中ITGA6與LncRNA MIR503HG、Vimentin表達呈明顯正相關(r=0.802、0.652,均P<0.05),與miR-32-5p、E-cadherin表達呈明顯負相關(r=-0.792、-0.671,均P=0.000)。

圖5 ITGA6表達影響NSCLC患者生存期

2.6miR-32-5p與ITGA6之間的雙熒光素酶實驗 miRDB生物信息數據庫顯示miR-32-5p和ITGA6能發生特異性結合。見圖6。雙熒光素酶實驗結果顯示,在升高miR-32-5p表達后,ITGA6(野生型)熒光素酶活性明顯下降(P<0.05),TGA6(突變型)熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05),說明在NSCLC中,miR-32-5p靶向ITGA6表達。見表4。

圖6 NSCLC中miR-32-5p與ITGA6的互補序列

表4 miR-32-5p與ITGA6雙熒光素酶結果

2.7miR-32-5p靶向ITGA6影響H1299細胞的體外增殖與轉移 細胞EDU染色增殖實驗結果顯示,與Normal組相比,agomir組、agomir+pc組EDU陽性細胞比例明顯升高(P<0.05);與agomir組相比,agomir+pc組EDU陽性細胞比例明顯升高(P<0.05)。細胞遷移實驗結果顯示,與Normal組相比,agomir組、agomir+pc組遷移細胞數量明顯降低(P<0.05);與agomir組相比,agomir+pc組遷移細胞數量明顯升高(P<0.05)。Western印跡實驗結果顯示,與Normal組相比,agomir組、agomir+pc組ITGA6、Vimentin表達水平明顯降低,E-cadherin表達水平明顯升高(P<0.05);與agomir組相比,agomir+pc組ITGA6、Vimentin表達水平明顯升高,E-cadherin表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖7、圖8、表5。

1～4:Normal組、agomic-NC組、agomir組、agomiR-PC組

圖8 miR-32-5p靶向ITGA6調控H1299細胞的體外增殖與轉移

表5 miR-32-5p靶向ITGA6對H1299細胞中ITGA6、Vimentin、E-cadherin表達的影響

2.8LncRNA MIR503HG/miR-32-5p/ITGA6對腫瘤細胞體內生長與病灶轉移的影響 與Normal組相比,LncRNA-mimic組、Lnc-mimic+agomir組、Lnc-mimic+agomir+pc組瘤體質量和病灶轉移比例明顯升高(P<0.05);與LncRNA-mimic組相比,Lnc-mimic+agomir組、Lnc-mimic+agomir+pc組瘤體質量和病灶轉移比例明顯降低(P<0.05);與Lnc-mimic+agomir組相比,Lnc-mimic+agomir+pc組瘤體質量和病灶轉移比例明顯升高(P<0.05)。Western印跡結果顯示,與Normal組相比,LncRNA-mimic組、Lnc-mimic+agomir組、Lnc-mimic+agomir+pc組ITGA6、Vimentin表達水平明顯升高,E-cadherin表達水平明顯降低(P<0.05);與LncRNA-mimic組相比,Lnc-mimic+agomir組、Lnc-mimic+agomir+pc組ITGA6、Vimentin的表達水平明顯降低,E-cadherin表達水平明顯升高(P<0.05);與Lnc-mimic+agomir組相比,Lnc-mimic+agomir+pc組ITGA6、Vimentin表達水平明顯升高,E-cadherin表達水平明顯降低(P<0.05),見圖9,圖10,表6、圖11。

1～5:Normal組、LncRNA-mimic-NC組、LncRNA-mimic組、LncRNA-mimic+agomir組、Lnc-mimic+agomir+pc組

1～5:Normal組、LncRNA-mimic-NC組、LncRNA-mimic組、Lnc-mimic+agomir組、Lnc-mimic+agomir+pc組

表6 各組瘤體質量、病灶轉移與瘤體組織中ITGA6、Vimentin、E-cadherin相對表達

圖11 5組H1299細胞體內病灶轉移

3 討 論

隨著環境污染及生活方式的極大改變,肺癌尤其是NSCLC的發病率逐年升高。盡管NSCLC的預防、臨床診斷、治療均在生命技術的影響下出現了較為可喜的變化,但是疾病的分子機制尚未明確,治療手段存在諸多限制,其5年生存率尚未令人滿意,而大多數NSCLC患者經常規治療后,仍具有較高的復發率和靶器官轉移的風險。研究〔9〕顯示,腫瘤細胞的無限增殖能力、對靶器官(尤以胃、乳腺等為主)的惡性侵襲能力是癌細胞最主要的惡性功能表型,也是導致患者失去生命的關鍵因子。因此,更為系統、深入的闡明NSCLC細胞增殖與轉移的分子機制,及時而有效的加以安全高效的干預,是NSCLC臨床治療急需解決的挑戰之一。

LncRNAs是由約為200個核苷酸組成的單鏈RNA,研究〔10〕顯示,LncRNAs通過參與染色體修飾、基因轉錄水平及轉錄后的激活等過程參與細胞的增殖、侵襲與轉移;而miRNAs是由22個核苷酸組成的單鏈生化小分子,研究〔11〕顯示,miRNAs通過與靶基因的特異性位點結合,調控其表達或轉錄水平,在細胞增殖、侵襲、衰老及血管生成等生物學過程中發揮重要作用。隨著人類基因組計劃研究的深入,研究〔12〕顯示,作為生物體內重要的非編碼基因,具有龐大數量的LncRNAs及miRNAs的表達異常在機體癌癥、組織損傷與修復、自身免疫性疾病等多種疾病中發揮重要作用。Zhao等〔13〕研究顯示,在宮頸鱗狀癌組織中LncRNA MIR503HG表達水平明顯升高,表達異常升高的LncRNA MIR503HG促進宮頸癌的進展,沉默其表達后,能明顯降低癌細胞的增殖活性。Qin等〔14〕研究報道,miR-32-5p在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達明顯降低,升高其表達后,能明顯升高口腔鱗狀細胞中E-cadherin表達,下調口腔鱗狀細胞中Vimentin表達,直接影響癌細胞上皮間質轉化過程。細胞外基質的降解與重塑是腫瘤細胞惡性增殖及遠處轉移中的關鍵環節。作為整合素家族最為重要的成員,ITGA6定位于染色體2q31.1,其表達水平的高低與腫瘤進展及靶器官轉移密切相關〔15〕。研究〔16〕顯示,ITGA6不僅是細胞膜表面最關鍵的黏附分子,調節細胞間的黏附,還能增強促癌基因與信號的表達水平,調控腫瘤細胞增殖、分化、遷移與侵襲等生物學行為。Guo等〔17〕研究顯示,ITGA6在肝癌組織中呈現高表達現象,并且高表達ITGA6增強了細胞體外增殖與轉移活性。本研究得到類似結論。

綜上,NSCLC中LncRNA MIR503HG、ITGA6表達明顯升高,miR-32-5p表達明顯降低,LncRNA MIR503HG靶向miR-32-5p調控ITGA6的表達影響H1299細胞的增殖與轉移能力,但是如何將這一靶向作用用于NSCLC的臨床診斷與治療中,還需要結合更多的系統研究做出最為適宜的研判。