檳榔提取物通過上調Max蛋白對口腔鱗癌細胞遷移、侵襲的影響

肖旭 李澤濛 劉佩 李鵬程

(海南醫學院 1第一附屬醫院口腔頜面外科,海南 ?？?570100;2第二附屬醫院口腔科)

口腔鱗癌全稱為口腔鱗狀細胞癌,在臨床口腔科屬于較為常見的口腔惡性腫瘤,其發生部位為人口腔頜面部位置,是由于口腔的鱗狀上皮發生了惡變,從而發展為惡性腫瘤?？谇击[癌在發生時會存在較高的侵襲及轉移性,其發病率在口腔癌中占據90%居多〔1〕?，F代隨著醫學方面的不斷進步發展,已經顯著降低該惡性腫瘤疾病的發病率,目前臨床基本控制在50%左右〔2〕。臨床對于口腔鱗癌的治療常采用放療、化療及手術等方式進行治療,但在治療后患者5年的生存率相對較低,而在進行治療的過程中通過相關的中藥、植物的提取物能夠通過實行靶向調控來達到抗癌效果〔3〕。檳榔屬于棕櫚科植物的一種,其主要生存于海南、云南西雙版納等熱帶雨林地區,而作為重要的檳榔在四大南藥中位居首位〔4〕。檳榔自身存在較多人體所需的如檳榔堿、干露糖、氨基酸等多種營養元素及活性成分〔5〕。檳榔提取物能夠通過對順鉑引導的口腔癌疾病產生一定的功效,并且能夠升高機體內的自噬活性進行〔6〕。MYC關聯因子X(Max)以蛋白的形態存在于機體內,會直接參與多種惡性腫瘤疾病的發生發展,但檳榔提取物是否可通過上調Max表達從而對口腔鱗癌細胞遷移、侵襲產生影響還尚未可知〔7〕。本研究探討檳榔提取物通過上調Max蛋白對口腔鱗癌細胞遷移、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1研究對象 購買CAL127人口腔鱗癌細胞。(購買于中國豐暉生物公司)。實驗試劑:(1)購買自海南新鮮干燥的檳榔果。將其進行去皮,隨后進行稱重,城中30 g的檳榔干果,將稱重過后的檳榔干果置于4 ℃的去離子水中,進行60 min的機械研磨。將研磨后的檳榔提取物同故宮離心機以12 000 r/min,離心半徑10 cm的條件下進行離心處理8 min,離心后獲取檳榔上清液,并進行過濾,帶過濾后置于-80 ℃冷凍干燥機內進行濃縮凍干,從而獲取干燥且呈現出粉狀的檳榔提取物。對粉狀檳榔提取物進行稱重,稱重后將其與離子水進行溶解,回去最終的檳榔提取物水溶液,以1 mg/ml講檳榔提取物保存至-25 ℃的低溫中待用。(2)DMEM培養基(上海吉至生化科技有限公司),超級胎牛血清(鄭州九龍生物制品有限公司)、RIPA蛋白裂解液、四噻唑藍(購自Hyclone,美國),結晶紫染液、聚偏氟乙烯膜(購自碧云天生物技術研究所),血小板源性生長因子(P-PDGFB)、磷酸化血小板源性生長因子(PDGFR)β、細胞周期蛋白(Cyclin)D1蛋白、Max/GAPDH抗體,山羊抗大鼠ROCK一抗、兔抗鼠IgG二抗(均購自武漢純度生物科技有限公司)。

1.2儀器設備 Multi-skan MK3型酶標儀(美國Thermo公司);Transwell小室(南京迅貝生物科技有限公司);CO2培養箱(河北慧采科技有限公司);培養板(阿爾法生物實驗器材有限公司);BX53半電動熒光顯微鏡(上海儀景通光學科技有限公司);雙垂直電泳儀(深圳市康初源有限公司)。

1.3方法 將購買的CAL127人口腔鱗癌細胞放置于含有10%的超級胎牛血清的DMEM培養基內進行培養,其培養的條件為:37 ℃、5% CO2條件下。當CAL127人口腔鱗癌細胞處于對數生長期時對其進行實驗,在進行飾演的過程中將實驗分為對照組、低、中、高濃度檳榔提取物(低、中、高濃度)組。對照組:將CAL127人口腔鱗癌放置于含有10%的超級胎牛血清的DMEM培養基內進行培養;低濃度組:在DMEM培養基內加入10 μmol/L檳榔提取物;中濃度組:在DMEM培養基內加入20 μmol/L檳榔提取物;高濃度組:在DMEM培養基內加入30 μmol/L檳榔提取物。各組均進行24 h的培養。

1.4Max相對表達量檢測 采用實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)法測定Max相對表達量,采用Max試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)提取血液內RNA,用RT-qPCR試劑盒進行反轉錄反應,將cDNA,產物進行PCR擴增。條件參數為預火95 ℃預變性10 min,取出降溫至85 ℃,變性5 s,迅速降溫至60 ℃,退火15 s,溫度保持50 ℃,延伸45 s,35個循環,重復實驗3次。內參GAPDH上游引物:5＇-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3＇,下游:5＇-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3＇;Max上游引物:5＇-CCTGGGCCCTAGGAAATGAG-3＇,下游:5＇-TAGAGCAGGCGTGGTCCAG-3＇。以GAPDH為內參,采用2-ΔΔCt方法計算Max相對表達量。

1.5檢測細胞遷移 通過進行劃痕實驗檢驗胃癌細胞株的遷移能力,選取胃癌細胞株用胰蛋白酶分解,獲取細胞懸液接種到6孔板上,并用1.60 ml移液器槍頭對所有單層細胞從上至下畫一條劃痕,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌刮下細胞,向干凈培養基中加入4 ml溶液,37 ℃下培育29 h,棄去培養液,在顯微鏡下觀察并記錄視野平均值,重復3次,取細胞遷移數平均值。

1.6檢測細胞侵襲 在24孔板中放置Transwell小室,在Transwell小室層中加入50 μl的基質膠,并在37 ℃ 5%的CO2的培養箱中過夜,直到基質膠完全凝固,然后在24孔下室中加入500 μl含有10%胎牛血清的RPMI1640培養液,Transwell小室中加入100 μl的胃癌細胞懸液,48 h以后吸除24孔板下室中的培養液,用0.1%的結晶紫溶液進行染色6 min,對口腔鱗癌細胞的侵襲個數進行觀察。

1.7Western印跡法測定PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白相對表達量 轉染48 h后提取蛋白,用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。與緩沖液混合100 ℃煮沸5 min后電泳。在90 V、4 ℃下靶蛋白轉移至NC膜上,轉膜時間為90 min,封閉:5%胎牛血清白蛋白,室溫孵育60 min。經NC膜放置在1∶900稀釋一抗中4 ℃進行孵育。二抗室溫1 h后顯色。對細胞凋亡相關蛋白PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1相對表達量進行檢測。

1.8統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行獨立樣本t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1各組Max蛋白表達對比 與對照組(1.02±0.23)相比,低、中、高濃度組Max蛋白表達(2.34±0.38、3.57±0.47、4.81±0.52)均升高,具有統計學差異(P<0.05);與低濃度組相比,中、高濃度組Max表達均升高,具有統計學差異(P<0.05);與中濃度組相比,高濃度組Max表達升高,具有統計學差異(P<0.05)。

2.2各組口腔鱗癌細胞遷移能力對比 如表1、圖1所示,與對照組相比,低、中、高濃度組口腔鱗癌細胞遷移能力均降低,具有統計學差異(P<0.05);與低濃度組相比,中、高濃度組口腔鱗癌細胞遷移能力均降低,具有統計學差異(P<0.05);與中濃度組相比,高濃度組遷移能力降低,具有統計學差異(P<0.05)。

2.3各組口腔鱗癌細胞侵襲率對比 如表1、圖2所示,與對照組相比,低、中、高濃度組口腔鱗癌細胞侵襲個數均降低,具有統計學差異(P<0.05);與低濃度組相比,中、高濃度組口腔鱗癌細胞侵襲個數均降低,具有統計學差異(P<0.05);與中濃度組相比,高濃度組侵襲個數降低,具有統計學差異(P<0.05)。

2.4各組口腔鱗癌細胞周期分布情況對比 如表1所示,高濃度組口腔鱗癌細胞處于G0/G1期均高于對照組、低、中濃度組(P<0.05);高濃度組口腔鱗癌細胞處于S期均低于對照組、低、中濃度組(P<0.05);低濃度組口腔鱗癌細胞處于G2/M期高于對照組、中、高濃度組,高濃度組口腔鱗癌細胞處于G2/M期低于對照組、低、中濃度組,具有統計學差異(P<0.05)。

2.5各組口腔鱗癌細胞增殖、凋亡率對比 如表1所示,與對照組相比,低、中、高濃度組口腔鱗癌細胞增值率均降低,凋亡率均升高,具有統計學差異(P<0.05);與低濃度組相比,中、高濃度組口腔鱗癌細胞增值率均降低,凋亡率均升高,具有統計學差異(P<0.05);與中濃度組相比,高濃度組增值率均降低,凋亡率均升高,具有統計學差異(P<0.05)。

表1 各組口腔鱗癌細胞遷移、侵襲能力、細胞周期分布、增殖及凋亡率對比

圖1 各組口腔鱗癌細胞遷移(×200)

圖2 各組口腔鱗癌細胞侵襲(結晶紫染色,×200)

2.6各組口腔鱗癌細胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表達對比 如表2、圖3所示,與對照組相比,低、中、高濃度組口腔鱗癌細胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表達均降低,具有統計學差異(P<0.05);與低濃度組相比,中、高濃度組口腔鱗癌細胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表達均降低,具有統計學差異(P<0.05);與中濃度組相比,高濃度組口腔鱗癌細胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表達降低,具有統計學差異(P<0.05)。

表2 各組口腔鱗癌細胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表達對比

圖3 各組口腔鱗癌細胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表達

3 討 論

口腔鱗癌在當前臨床中的發病率相對較高,并且患者在進行治療后的5年生存率相對較低,并且會出現癌轉移而造成死亡,臨床致死率也相對較高〔8〕。因此臨床相關醫師進行多種相關實驗尋找較具療效的治療藥物,緩解患者疾病嚴重程度〔9〕。檳榔提取物時從檳榔果中提取而來,據相關研究表明〔10〕,當檳榔堿的濃度在10 μmol/L時,能夠對口腔黏膜成纖維細胞的增殖情況產生促進作用,但也有相關研究得出〔11〕,檳榔堿也會對口腔黏膜成纖維細胞的增殖情況進行抑制。

Max蛋白以蛋白的形態存在于機體內的細胞中,而相關研究指出〔12,13〕,Max蛋白在機體內屬于抑癌基因的一種,并且在機體出現癌變時,參與癌變全過程,能夠對癌細胞的分化和生長進行一定程度的調控。本研究結果表明,口腔鱗癌細胞中Max蛋白表達呈現上調趨勢,而對Max表達進行阻斷且降低檳榔提取物的濃度,其口腔鱗癌細胞的遷移和侵襲能力相對減弱。

細胞周期分為3個:DNA合成前期(G1/G0)、合成期(S)、合成后期(G2/M),S期是機體內細胞進行分裂增殖的重要時期,在這一時期前將細胞阻滯能夠有效地抑制癌細胞的發展〔14,15〕。相關研究顯示〔16,17〕,Max能夠有效地調控CAL127細胞改變癌細胞的周期分布。本研究結果說明,上調Max蛋白能夠降低口腔鱗癌細胞的相對表達量,能夠起到改變癌細胞周期分布的作用。

據相關研究指出〔18〕,采用不同濃度的蟲草素提取物對口腔鱗癌細胞的增殖、侵襲及遷移情況進行分析,高濃度蟲草素能夠顯著降低癌細胞的增殖率、遷移及侵襲能力〔19,20〕。本研究結果提示,檳榔提取物可能存在對口腔鱗癌細胞的遷移能力、侵襲個數進行抑制,從而達到相關治療效果。本研究還提示,不同濃度的檳榔提取物對口腔鱗癌細胞的增殖率也能夠產生降低作用,對腔鱗癌細胞凋亡率能夠產生升高作用,并且會隨著濃度升高,其增殖率會逐漸降低、凋亡率逐漸升高。并能抑制PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表達。而在高濃度下的Max蛋白表達也呈現升高狀態,其表達高于對照組、低、中濃度中的Max表達。PDGF在機體內以分裂原形態存在,并且能夠促進體外平滑及纖維細胞的分裂。據相關研究表明,PDGFB、p-PDGFRβ之間所產生的相互作用,能夠對癌細胞的遷移、侵襲能力產生關鍵作用。本研究結果顯示,PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白在口腔鱗癌細胞遷移、侵襲中具有重要作用。

綜上,不同濃度的檳榔提取物可通過上調Max蛋白的表達而對口腔鱗癌細胞的遷移、侵襲進行不同程度的抑制。