克洛己新干混懸劑對LPS誘導支氣管上皮細胞炎癥反應的作用

馮劍 朱寶 馮娜

(新鄭華信民生醫院呼吸內科,河南 新鄭 100022)

肺部疾病最常見的為慢性阻塞性肺疾病、哮喘和肺癌〔1〕。在肺組織中,支氣管上皮充當防御屏障保護其正常功能〔2〕。一旦支氣管上皮被外部刺激物激活,可能會產生活性氧自由基(ROS),導致肺部炎癥和肺組織損傷。此外,氣道炎癥可導致氣道上皮細胞的損傷和功能障礙,從而加重呼吸道疾病的發病機制和進展〔3〕。研究表明,氣道疾病模型中的上皮細胞凋亡和炎癥因子釋放是促進氣道疾病發生發展的重要原因〔4〕。脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌的主要膜成分,對呼吸道細胞具有極高的毒性,并是一種有效的促炎活性誘導劑〔3〕。已知支氣管上皮細胞的激活與肺部疾病的許多方面有關〔5〕,肺支氣管上皮細胞對病原體的識別在LPS誘導的肺部炎癥中起重要作用。Toll樣受體(TLR)-4作為一種具有識別功能的受體,可結合下游絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和核轉錄因子(NF)-κB〔6〕?；罨腗APK和NF-κB可通過促進腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β及其他促炎細胞因子的表達來調節炎癥〔7〕。既往研究發現,頭孢類藥物、噻托溴銨等藥物可減輕支氣管上皮細胞的炎癥反應〔8,9〕?？寺寮盒赂苫鞈覄┯甥}酸溴己新和頭孢克洛合成,具有抗感染、抗菌等治療作用〔10〕,現已廣泛應用于臨床。然而,目前尚無證據支持其在LPS誘導支氣管上皮細胞炎癥反應中的保護作用。本研究利用人支氣管上皮細胞系BEAS-2B,從細胞層面探究克洛己新干混懸劑對LPS誘導支氣管上皮細胞炎癥損傷中的作用及其可能機制。

1 資料與方法

1.1一般材料 人支氣管上皮細胞系BEAS-2B購自上海富恒生物科技有限公司,LPS購自美國Sigma-Aldrich公司?？寺寮盒赂苫鞈覄┵徸越K正大清江制藥有限公司。CCK-8檢測試劑盒、凋亡檢測試劑盒分別購自日本Dojindo公司及美國Invitrogen公司。一級抗體TLR4、p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65及其對應二抗均購自美國Cell signaling technology公司。Western蛋白印跡實驗相關耗材包括RIPA蛋白提取試劑、封閉液、一抗及二抗稀釋液、化學發光顯影液均購自中國上海碧云天生物技術有限公司。

1.2細胞分組處理 實驗分為對照組(無干預)、LPS組(給予25 μg/ml LPS)、克洛己新干混懸劑組(給予1 mg/ml克洛己新干混懸劑)和LPS+克洛己新干混懸劑組(分別給予25 μg/ml LPS和1 mg/ml克洛己新干混懸劑)〔11〕。

1.3CCK-8法檢測細胞活性 將細胞以104個/孔的密度接種于96孔板中,按照分組進行相應操作后,每孔加入10 μl CCK-8試劑,放回培養箱繼續孵育3 h,放入分光光度計測定450 nm處吸光度(OD)值,計算各組細胞相對活性。

1.4膜聯蛋白Ⅴ/碘化丙啶(Annexin Ⅴ/PI)雙染色流式細胞儀測定細胞凋亡情況 將細胞以5×104個/孔的密度接種于6孔板中,按照分組進行相應操作后,按照試劑盒說明書,用預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞3次,1 000 r/min離心10 min留取細胞沉淀,加入500 μl結合緩沖液,依次加入10 μl Annexin V和5 μl PI染液后,室溫、避光孵育15 min后,將細胞樣品置入流式細胞儀中檢測細胞凋亡率。

1.5Western印跡法檢測蛋白表達水平 將細胞以5×104個/孔的密度接種于6孔板中,按照分組進行相應操作后,用預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞3次,加入RIPA細胞裂解液,在冰上裂解細胞30 min,4 ℃、12 000 r/min離心20 min提取上清液,使用蛋白濃度測定試劑盒測定樣品中的蛋白濃度。經凝膠電泳分離蛋白,轉膜、封閉、孵育相應一抗,次日室溫下進行二抗孵育,洗膜,化學發光液加于膜上,在熒光成像系統中進行蛋白條帶熒光成像。后使用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值,β-actin作為內參蛋白。

1.6DCFH-DA 法檢測細胞內ROS水平 將細胞以5×104個/孔的密度接種于6孔板中,按照分組進行相應操作后,收集細胞后用預冷的磷酸鹽緩沖液沖洗細胞3遍,加入 5 μmol/L DCFH-DA于37 ℃ 培養箱中避光孵育30 min,后用PBS沖洗細胞3遍。根據說明書指示,將細胞放入熒光酶標儀中,設置激發波長為485 nm,發射波長為530 nm,測定細胞熒光強度。計算熒光相對值,值越大提示ROS含量越高。

1.7酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞中TNF-α及IL-1β蛋白水平 將細胞以5×104個/孔的密度接種于6孔板中,按照分組進行相應操作后,收集細胞培養液,離心取上清后根據說明書測定蛋白表達水平,采用分光光度計測定450 nm處OD值,繪制標準曲線,計算蛋白濃度。

1.8統計學方法 采用SPSS22.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1各組細胞活性及凋亡情況比較 與對照組相比,LPS組和LPS+克洛己新干混懸劑組細胞活性顯著降低(t=11.71、5.51,均P<0.05);與LPS組相比,LPS+克洛己新干混懸劑處理可顯著增加細胞活性(t=11.02,P<0.05)。與對照組相比,LPS組和LPS+克洛己新干混懸劑組細胞凋亡率明顯增高(t=25.62、13.09,均P<0.05);與LPS組相比,LPS+克洛己新干混懸劑處理可顯著降低細胞凋亡率(t=11.69,P<0.05)。見表1。

2.2各組細胞ROS、TNF-α及IL-1β水平比較 與對照組相比,LPS組和LPS+克洛己新干混懸劑組細胞ROS水平顯著升高(t=18.00、6.92,均P<0.05);與LPS組相比,LPS+克洛己新干混懸劑處理可顯著降低細胞ROS水平(t=8.05,P<0.05)。此外,與對照組比較,LPS組及LPS+克洛己新干混懸劑組TNF-α(t=14.31、13.83,均P<0.05)及IL-1β水平(t=14.84、4.49,均P<0.05)顯著升高。相反,克洛己新干混懸劑可逆轉LPS引起的炎癥反應,顯著下調TNF-α和IL-1β水平(t=6.89、8.93,均P<0.05),見表1。

表1 各組細胞活性及凋亡率、細胞ROS、TNF-α、IL-1β水平比較

2.3各組細胞TLR4/MAPK/NF-κB信號通路激活情況 與對照組相比,LPS組TLR4、MAPK、NF-κB蛋白表達明顯增加(t=11.92、15.43、15.00,均P<0.05),提示該通路被激活。此外,LPS+克洛己新干混懸劑組TLR4/MAPK/NF-κB信號通路也有一定程度活化(t=4.38、7.70、8.13,均P<0.05)。與LPS組比較,LPS+克洛己新干混懸劑組TLR4、MAPK、NF-κB蛋白均顯著降低(t=9.62、5.22、8.11,均P<0.05),提示盡管LPS可以使該通路活化,但克洛己新干混懸劑治療可抑制其活化,見表2。

表2 各組細胞TLR4/MAPK/NF-κB信號通路活化情況

3 討 論

克洛己新干混懸劑作為一種復合制劑藥物,包含頭孢克洛和鹽酸溴己新,目前臨床上多用于抗感染、止咳化痰等治療目的。既往關于克洛己新干混懸劑的研究多聚焦于臨床應用。李燕梅等〔11〕發現,該藥物在治療小兒慢性咳嗽方面的效果顯著,可有效緩解咳嗽癥狀及炎癥反應;此外,使用克洛己新干混懸劑可有效減輕銅綠假單胞菌誘發PA肺炎小鼠的肺損傷情況,還可抑制小鼠血清炎癥因子表達〔12〕。

本研究發現,LPS可顯著誘導支氣管上皮細胞活性降低,誘導凋亡反應的發生,與Liu等〔5〕及Lv等〔13〕的研究結果相一致。當同時給予克洛己新干混懸劑治療,可明顯逆轉上述變化,增加細胞活性及抑制凋亡反應的發生。此外,本研究還發現,LPS可明顯增加支氣管上皮細胞的ROS、TNF-α及IL-1β水平,還首次發現當同時使用克洛己新干混懸劑干預可顯著降低上述因子水平,提示克洛己新干混懸劑治療可減輕由LPS引起的支氣管上皮細胞損傷及炎癥反應,從而達到保護細胞的目的。

在其機制研究方面,已知TLR-4/MAPK/NF-κB信號通路在LPS誘導肺損傷中扮演重要角色〔14,15〕。如Tao等〔14〕發現,羅漢果中的活性成分通過下調TLR-4/MAPK/NF-κB信號通路,在LPS誘導的急性肺損傷炎癥反應中發揮關鍵作用。本研究發現,LPS誘導了支氣管上皮細胞中TLR-4/MAPK/NF-κB通路的激活,而同時給予克洛己新干混懸劑治療時,上述信號通路活性被顯著抑制,具體表現為TLR-4蛋白表達減少,MAPK及NF-κB的磷酸化水平降低。該發現為克洛己新干混懸劑在LPS誘導肺支氣管上皮細胞中的抗炎作用提供了進一步的理論支持。

綜上,克洛己新干混懸劑可通過抑制由LPS引起的人肺支氣管上皮細胞活性降低、凋亡反應增加、氧化應激標志物ROS及細胞炎癥因子TNF-α及IL-1β的水平,此外還可抑制TLR-4/MAPK/NF-κB通路的激活,從而發揮保護性作用。上述發現為治療由LPS引起的肺損傷提供了新思路及理論依據。