miR-34a-5p靶向調控MMP-9對類風濕關節炎大鼠氧化應激及滑膜細胞分化的作用機制

王建梅 強樹華 高虹 劉丹丹 霍晶

(臨汾市中心醫院風濕免疫科,山西 臨汾 041000)

類風濕關節炎(RA)主要特征為滑膜炎癥、關節軟骨破壞、骨質疏松和全身性炎癥反應,具有高致殘率的特點,有調查顯示,其致殘率高達50%,已經成為全球導致勞動能力喪失的第31位疾病,故有“不死的癌癥”之稱〔1〕。近年來研究表明,氧化應激在RA的發生、發展中具有極其重要的作用,發生氧化應激時,機體會產生大量活性氧簇和活性氮簇,從而導致機體抗氧化能力下降,進而造成滑膜組織、肺組織等的損傷,加重疾病,因此抗氧化應激對治療RA至關重要〔2〕。RA的一個典型病理特征就是骨破壞,而破骨細胞是其中的關鍵因素,破骨細胞主要由滑膜細胞分化而來,故抑制滑膜細胞分化成破骨細胞對RA的發生和發展起著至關重要的作用〔3〕?；|金屬蛋白酶(MMP)在RA的滑膜炎癥和關節破壞中扮演著關鍵的角色,MMP-9是其主要成員,可促進血管中內皮遷移和形成新管腔,在RA血管翳的形成中扮演著重要角色〔4〕。近年來,越來越多的研究表明,微小RNA(miRNA)參與了RA的發生和發展過程,是骨損傷疾病最重要和最活躍的調控因子之一〔5〕。miR-34a-5p是一種可在不同器官發揮多效性調節功能的 miRNA,有研究表明,其可對成骨細胞起到一定保護作用,故促進miR-34a-5p表達可作為治療RA的一個新靶點〔6〕。但其在治療RA方面目前臨床幾乎沒有研究,本文探討miR34a-5p靶向調控MMP-9對RA大鼠氧化應激及滑膜細胞分化的作用機制

1 材料與方法

1.1動物材料 本實驗選取湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供的70只SPF級SD雄性大鼠〔合格證書為:SCXK(湘)2020-0004〕,體質量210～270 g,溫度26 ℃、52%相對濕度、自然光照下飼養,按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗。

1.2實驗材料 弗氏完全佐劑(貨號:F5881,上海睿安有限公司);miR-34a-5p mimic(貨號:CMR0082,廣州威佳有限公司);重組腺病毒載體轉染試劑盒(貨號:GMS60036,上海杰美有限公司);MMP-9抑制劑鹽酸多西環素(貨號:YT69064,北京伊塔有限公司);蘇木素-伊紅(HE)染液(貨號:BIR615,北京博爾西有限公司);光學顯微鏡(型號:E100,上海普赫有限公司);實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR)儀(型號:6000,上海鉑力有限公司);cDNA 第一鏈合成試劑盒(貨號:YLK-T0057,上海優利科有限公司);多功能酶標儀(型號:Spark,北京賽百奧有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(貨號:042-02801,廣州威佳有限公司);丙二醛(MDA)試劑盒(貨號:YT-C-A333,上海韻泰有限公司);4′,6-二氨基-2-苯基吡啶(DAPI)染色液(貨號:FT21949yy,上海梵態有限公司);降鈣素受體(CTR)抗體(貨號:201675-T02,北京義翹神州股份有限公司);熒光顯微鏡(型號:Primo Star iLED,上?？柌趟居邢薰?。

1.3建模 隨機選取55只大鼠,進行RA建模,大鼠固定好,后肢消毒,于足趾皮下注射0.1 ml弗氏完全佐劑,7 d后再注射1次,觀察大鼠后肢情況,當出現明顯紅腫且后腫脹持續,則視為建模成功,建模過程中無大鼠死亡,全部建模成功。

1.4基因轉染 根據重組腺病毒載體轉染試劑盒說明書,將miR-NC和miR-34a-5p mimic質粒與載體分別加入不含血清的DMEM培養液中,并在溫室條件下孵育10 min。然后,將等量的miR-NC和miR-34a-5p mimic加入脂質體中,并配制成轉染液。最后,將密封保存這些轉染液,以備后續的實驗使用。

1.5分組及給藥 從建模成功的大鼠中隨機選取50只,將其分為模型(B)組,miR-NC(C)組,miR-34a-5p mimic(D)組,MMP-9抑制劑(E)組,miR-34a-5p mimic+MMP-9抑制劑(F)組,每組10只,同時隨機選取10只正常大鼠作為正常對照(A)組,對C組給予尾靜脈注射0.5 ml 1×105/ml的miR-NC,對D組給予尾靜脈注射0.5 ml 1×105/ml的miR-34a-5p mimic,對E組給予尾靜脈注射30 mg/kg的鹽酸多西環素,對F組給予miR-34a-5p mimic聯合鹽酸多西環素,每組均1次/d,持續28 d,A、B組同期給予同體積生理鹽水。

1.6標本采集 實驗完成后,75 mg/kg的氯胺酮麻醉處死大鼠,腹主動脈取血離心取上清液于冰箱中密封保存,同時取滑膜組織,常規石蠟包埋、切片,4%多聚甲醛固定96 h,放入冰箱中密封保存。

1.7HE法檢測大鼠滑膜組織病理形態 取部分滑膜組織,行脫蠟和至水處理后,用蘇木素染色5 min,酸水及氨水中分色,各5 s,流水沖洗后,用70%及90%的酒精依次脫水10 min,用伊紅染液染色2 min,染色完成后,用梯度乙醇和二甲苯進行脫水和透明化處理,最后使用中性樹膠封片,用光學顯微鏡進行組織病理學觀察。

1.8Real-time PCR 法檢測大鼠滑膜組織中miR-34a-5p、MMP-9 mRNA相對表達 取各組滑膜組織,trizol 試劑提取總RNA,電泳儀檢測其完整性,cDNA 第一鏈合成試劑盒逆轉錄合成 cDNA;利用Real-time PCR儀,在94 ℃條件下預變性10 min,變性30 s,70 ℃延伸1 min,59 ℃退火30 s,此循環進行40次,收集miR-34a-5p、MMP-9熒光信號,反應結束后進行數據分析,以同一樣本中U6的Ct值作為內參,采用 2-ΔΔCt計算其基因相對表達量。引物序列(5′-3′):miR-34a-5p:上游TGCGCTGGCAGTGTCTT-AGCTG、下游CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA,長度145 bp;MMP-9:上游TGTACCGCTATGGTTACACTCG、下游GGCAGGGACAGTTGCTTCT,長度153 bp;U6:上游CTCGCTTCGGCAGCACA、下游AACGCTTCA-CGAATTTGCGT,長度128 bp。

1.9各組氧化應激相關指標檢測

1.9.1黃嘌呤氧化酶法檢測大鼠血清中SOD水平 取各組大鼠血清,嚴格按照其實驗步驟進行實驗,首先按照試劑說明書配制好試劑,然后用均勻器進行混勻,37 ℃水浴40 min后,在波長550 nm處進行蒸餾水凋零,實驗完成后立即用酶標儀測定每孔光密度(OD)值,繪制標準曲線,然后通過標準曲線,計算SOD含量。

1.9.2硫代巴比妥酸法檢測大鼠血清中MDA水平 取各組大鼠血清,嚴格按照其實驗步驟進行實驗,首先按照試劑說明書配制好試劑,然后用均勻器進行混勻,100 ℃水浴40 min后冷卻,然后在3 000 r/min的條件下離心10 min,取上清液,用酶標儀在523 nm處測定每孔OD值,繪制標準曲線并計算MDA。

1.10免疫熒光法檢測大鼠滑膜組織中破骨細胞標志物CTR蛋白表達 取各組滑膜組織,二甲苯及梯度乙醇脫蠟水化后,滴加適量pH6.0的0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液,然后放入微波爐進行組織抗原修復,修復完成后冷卻至室溫,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,加入封閉液封閉30 min后,滴加稀釋的CTR一抗(1∶50),濕盒中4 ℃孵育過夜,PBS洗滌3次,滴加稀釋后的熒光標記的免疫球蛋白(Ig)G二抗(1∶100),濕盒中37 ℃孵育1 h,PBS洗滌4次,滴加 DAPI避光孵育5 min,PBS洗滌4次,充分洗去多余的DAPI,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,使用IPP6.0軟件對免疫熒光照片進行光密度分析。

1.11統計學分析 采用GraphPad Prism8.0軟件行t檢驗、χ2檢驗、方差分析、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1各組滑膜組織HE染色結果 A組滑膜組織細胞結構正常且排列整齊,未見關節腔滲出、水腫、充血及炎性細胞浸潤現象,B、C組出現彌漫性滑膜細胞和纖維組織增生,并可見大量血管翳形成及大量炎性細胞浸潤現象,D、E、F組可見滑膜細胞輕度增生及少量炎性細胞浸潤和新生毛細血管形成,水腫、充血情況明顯改善,見圖1。

圖1 各組滑膜組織(HE染色,×400)

2.2各組滑膜組織中miR-34a-5p、MMP-9 mRNA相對表達結果 與A組比較,B組、C組滑膜組織中miR-34a-5p mRNA表達顯著降低,MMP-9 mRNA明顯升高(均P<0.05),B組與C組相比無明顯差異(P>0.05),與C組相比,D、E、F組滑膜組織中miR-34a-5p mRNA表達顯著升高,MMP-9 mRNA顯著降低(P<0.05),且D組與E組相比無明顯差異(P>0.05),而F組較E組變化顯著(P<0.05),見表1。

2.3各組血清中氧化應激相關指標 與A組比較,B、C組血清中SOD含量顯著降低,MDA明顯升高(均P<0.05),B組與C組相比無明顯差異(P>0.05),與C組相比,D、E、F組血清中SOD含量顯著升高,MDA顯著降低(均P<0.05),且D組與E組相比無明顯差異(P>0.05),而F組較E組變化顯著(P<0.05),見表1。

表1 各組滑膜組織中miR-34a-5p、MMP-9 mRNA相對表達及血清中SOD、MDA含量

2.4所有大鼠miR-34a-5p與MMP-9相關性 miR-34a-5p與MMP-9呈負相關(r=-0.952,P<0.001)。

2.5各組滑膜組織中CTR蛋白表達結果 A、B、C、D、E、F組滑膜組織中CRT蛋白表達(0.54±0.05、2.12±0.12、2.13±0.12、1.35±0.11、1.36±0.12、0.69±0.07),差異有統計學意義(F=38.430,P<0.001),與A組比較,B、C組滑膜組織CTR蛋白表達明顯升高(P<0.05),B組與C組相比無明顯差異(P>0.05),與C組相比,D、E、F組滑膜組織CTR蛋白表達顯著降低(P<0.05),且D組與E組相比無明顯差異(P>0.05),而F組較E組顯著降低(P<0.05),見圖2。

圖2 各組滑膜組織CTR蛋白表達(免疫熒光,×400)

3 討 論

RA目前已被世界衛生組織定為醫學界難治性疾病,幾乎所有患者關節功能都會出現不同程度的喪失,同時累及血液、消化、呼吸系統等多種器官,對患者及其家庭,乃至社會均造成了極大負擔〔7〕。miRNA能通過與基因表達調控相關的mRNA結合,從而抑制或降低目標基因的表達,近年來研究發現,其被發現在包括RA在內的多種疾病中起著重要的調控作用〔8〕。

本研究發現,促進miR-34a-5p對RA具有治療作用。miR-34a-5p作為miR的一種,其可通過多種方式調控下游靶基因,進而參與細胞凋亡、增殖等多種生物學活動,同時有研究表明,其可通過調控成骨細胞及破骨細胞功能參與骨損傷疾病的病理過程〔9〕。RA的致病因素復雜,但有研究表明其主要與炎癥、自身免疫反應等多種機制導致的細胞外基質降解引起的關節系統損傷有關〔10〕。MMP-9可以降解膠原蛋白,參與滑膜細胞的遷移、侵襲及滑膜血管新生等過程,高水平的MMP-9活性與RA關節炎癥的嚴重程度和滑膜細胞異常增殖有關〔11,12〕。而對于RA大鼠,miR-34a-5p激動劑可能是通過促進miR-34a-5p的轉錄及翻譯,來促進其蛋白質的合成及促進其識別MMP-9的RNA,從而參與基因轉錄后水平的調控、并降解MMP-9,達到影響MMP-9基因蛋白質合成的目的,進而抑制細胞外基質的合成與降解、并參與細胞過程的調控、抑制炎性因子的分泌、促進滑膜細胞的凋亡等,最終有效改善疾病狀況?；粜禄鄣取?3〕研究發現,MMP-9在RA大鼠關節滑膜組織中表達升高,給予治療后其水平顯著降低,這與本文結果類似。

本研究表明,miR-34a-5p激動劑可顯著抑制氧化應激。SOD可清除活性氧生成過程中的初始產物,是機體內氧自由基的頭號殺手,可保護細胞免受自由基攻擊,因此其被看作自由基的第一線防御機制;而MDA是細胞膜被氧化后形成的脂質過氧化物,在機體內脂質過氧化損傷中扮演著重要角色,可對細胞具有直接的損傷作用,其含量的多少反應機體內脂質過氧化損傷的程度,同時也是組織器官損傷的重要標志,因此SOD及MDA均是反映氧化應激狀態的重要指標〔14,15〕。近年來研究發現,在RA中,氧化應激水平升高會引起滑膜細胞的功能失調和炎癥的發生,因此如何抑制氧化應激是目前臨床工作的重點所在〔16〕。對于RA大鼠,miR-34a-5p激動劑可能是通過抑制上游免疫細胞的活化及相關信號通路的表達,來抑制細胞凋亡因子在滑膜細胞中的表達、抑制細胞外基質的合成與降解等,從而抑制鈣離子的轉運、抑制多種黏附分子基因表達劑細胞膜脂質過氧化、抑制部分蛋白酶的活性,并改善細胞膜的流動性及通透性,進而有效清除氧自由基、到達抑制氧化應激水平,減少血小板聚集和血栓形成的目的,最終有效改善疾病癥狀。孫艷秋等〔17〕研究發現,RA中SOD含量顯著降低,MDA顯著升高,Linc00638在RA患者中低表達,過表達Linc00638可顯著改善氧化應激指標,這與本文結果類似。

本研究說明,miR-34a-5p激動劑可有效抑制滑膜細胞向破骨細胞分化。RA屬于慢性自身免疫性疾病,以侵蝕性、對稱性多關節炎為主要臨床表現,其一個典型病理特征就是骨破壞,因此如何抑制骨破壞是近年來醫學領域關注的焦點之一〔18〕。而破骨細胞是造成RA骨破壞的關鍵細胞,其主要來源于關節滑膜細胞的分化,其中CTR是破骨細胞表面的標志性分子,故其水平的變化可有效反映滑膜細胞分化成破骨細胞的程度〔19〕。而對于RA大鼠,miR-34a-5p激動劑可能是通過調控免疫炎癥相關信號通路,來抑制免疫炎癥反應,從而參與細胞膜、細胞質等細胞器的形成,影響破骨樣分化因子的生成,進而抑制滑膜細胞分化成破骨細胞,到達抑制破骨細胞活性的目的,最終有效減輕骨損傷。賀龍剛等〔20〕研究發現,RA中破骨細胞數量明顯增多,給予治療后,破骨細胞數量明顯減少,病理癥狀明顯改善,這與本文結果類似。