肝豆狀核變性患者的臨床表型和ATP7B基因變異分析①

李曉娜,趙雪杰,張 璐,種麗莉,石大鵬,董海波

(河南大學附屬鄭州頤和醫院檢驗醫學中心,河南 鄭州 450047)

肝豆狀核變性(wilson disease, WD)是一種常染色體隱性遺傳的原發性銅代謝障礙性疾病,發病機制為ATP7B基因突變導致編碼的ATP7B蛋白改變,引起血清銅藍蛋白合成減少及排銅障礙。全球WD患病率約為0.25/10 000～4/10 000,致病基因攜帶率為1/150～1/90[1,2]。WD可發病于任何年齡,以兒童及青少年多見,早期臨床以轉氨酶升高,銅藍蛋白降低為主就診,臨床呈現隱匿和多樣性,容易造成誤診或漏診[3]。WD的診斷需要結合臨床癥狀、銅代謝和ATP7B基因變異的診斷評分系統。ATP7B基因的分子診斷成為早期確診WD 的主要方法,同時為先證者親屬的篩查提供遺傳學依據。本研究通過對50例WD患者及部分親屬進行ATP7B基因檢測,了解WD患者的臨床表現與ATP7B基因變異的特點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 依據患者知情同意及河南大學附屬鄭州頤和醫學倫理委員會批準,所有基因診斷均取得了患者及家屬的同意并簽署了知情同意書。收集2018年11月至2022年4月經鄭州頤和醫院神經內科六(肝豆科)確診的50例WD患者。診斷依據為2003年Roberts等提出的肝豆狀核變性臨床指南。研究對象確診的50例WD患者及部分患者的父母及同胞,其中還包含一個家系的產前診斷。先證者來自河南、北京、山東、黑龍江、遼寧等北方省份,患者中男28例,女22例;漢族49例、滿族1例,均否認近親結婚。

1.1.2 臨床資料收集:通過醫院電子病例HIS系統收集患者臨床資料,包括一般情況(性別、年齡、家族史等),臨床表現,體格檢查,實驗室檢查包括血常規、丙氨酸轉氨酶(alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate transaminase,AST)、血清銅藍蛋白、血清銅等,影像學檢查包括腹部彩超和腎臟彩超、頭顱MRI等。

1.1.3 分組:根據起病時臨床癥狀,結合臨床分型參照中華醫學會神經病學分會帕金森病及運動障礙學組《肝豆狀核變性的診斷與治療指南》,分為肝型組、腦型組和混合型組。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取:采用乙二胺四乙酸鹽(ethylenediaminetetraacetic acidm, EDTA)抗凝管抽取受試者3mL靜脈血,用Biospin 全血基因組DNA提取試劑盒(購自杭州博日生物科技公司)提取DNA,TE(Tris-EDTA)緩沖液溶解,調解DNA濃度100μg·μL-1。

1.2.2 PCR擴增:采用Primer5軟件設計引物擴增ATP7B基因編碼蛋白的21個外顯子,由北京六合華大基因科技有限公司合成,PCR反應體系含純水8.μL,Ex Taq酶12.5μL,正向引物1uL,反向引物1μL ,DNA模板2μL,總反應體系25μL。PCR反應條件為94℃ 5 min;94℃ 30s、62℃30s、72℃40s,共35個循環,72℃ 5 min后4℃保存。

1.2.3 Sanger測序:對PCR產物進行Sanger測序(北京六合華大基因科技有限公司),用Sequencher軟件將測序結果與標準序列比對,尋找基因突變點。通過檢索文獻及PubMed數據庫( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)來確定突變的致病性。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 臨床特點

50例患者包含男28例,女22例;年齡2～54(17.28±11.23)歲,其中18歲以下有38例(76%),其中9例(18%)有明確的家族史。根據臨床癥狀分為肝型14例(28%)主要為兒童體檢發現轉氨酶升高,如果患者沒有臨床表現而僅僅有肝功能的轉氨酶升高,臨床分型可歸類于癥狀前期;腦型28例(56%)主要為語言不清、行走不穩、雙手不自在抖動等癥狀;混合型8例(16%)主要為上腹疼痛、納差、尿黃、關節酸痛等癥狀。進一步實驗室檢查發現肝型組患者主要以血清ALT和AST升高為特點,與腦型組和混合型組比較有顯著性差異(P<0.05);3組患者血清銅和血清銅藍蛋白均存在不同程度的降低,其中肝型組和腦型組與混合型組比較銅藍蛋白水平有顯著性差異;部分患者存在血紅蛋白降低,女性中無統計學差異,男性患者血紅蛋白存在顯著性差異,見表1。

表1 肝型、腦型和混合型肝豆狀核變性患者的實驗室檢查結果比較

2.2 ATP7B基因Sanger測序結果

經ATP7B基因一代測序分析,50例WD患者中ATP7B基因變異結果,見圖1。35例檢出兩處突變(3例為純合子;32例為復合雜合子),13例檢出1處雜合突變,1例檢出3個雜合突變,1例檢出4處雜合突變。50例WD患者共檢出30種不同的ATP7B等位基因突變,包含錯義突變、移碼突變、無義突變和缺失/剪切位點突變等。最常見的等位基因突變為8號外顯子的c.2333G>T/Arg778Leu,等位基因頻率為31%,29例WD患者發生p.Arg778Leu變異且合并p.Leu770Leu變異,只發現一例c.2333G>A/Arg778Gln且無p.Leu770Leu變異,見圖1。其次是13號外顯子的c.2975C>T/Pro992Leu,等位基因頻率為11%,見表2。WD先證者一級親屬篩查發現23例攜帶者,檢出8種錯義突變,見表3。

圖1 ATP7B基因8號外顯子c.2333位點和c.2310位點的Sanger測序圖

表2 50例肝豆狀核變性患者ATP7B基因突變的分布及等位基因頻率

表3 23例ATP7B基因攜帶者的突變的分布及等位基因頻率

3 討論

WD致病基因位于染色體13q14.3,編碼一種銅轉運P型ATP酶(ATP7B蛋白),參與銅的跨膜轉運,故稱ATP7B基因[4]。ATP7B基因發生突變導致ATP7B蛋白功能喪失,使得銅藍蛋白的合成減少,銅過量沉積在肝臟等組織器官,出現一系列銅中毒的臨床癥狀[5,6]。本研究中38例患者在18歲前出現臨床癥狀,其中12例年齡<8歲,均為體檢發現轉氨酶升高,進一步檢查發現銅藍蛋白降低,ATP7B基因檢測發現致病位點突變。本文與Nagral等[7]研究發現WD發病多在5～35歲發病,年齡<10歲的患者多以肝臟癥狀首發的結果一致。血清銅藍蛋白可作大規模WD早期篩查的指標之一。同時還發現1例50歲以上起病患者,近來多個流行病學調查還發現40歲以上起病患者[8]。肝型WD患者的轉氨酶明顯高于腦型WD患者,且腦型WD患者的發病年齡比肝型WD患者晚,一些早期轉氨酶升高WD患者會慢慢出現腦型患者癥狀,這可能跟銅最先在肝臟內蓄積,繼而在腦、骨、腎臟、角膜等組織蓄積相關。

ATP7B基因主要突變為錯義突變、無義突變、缺失和剪切位點突變。本研究發現74%(34/50)的WD發現兩處及以上突變,26%(13/50)的WD患者只檢查到一處雜合突變。Ferenci[9]發現WD患者中2個突變的變異率為78.4%,一個突變的變異率為21.6%。WD的致病原因還包括ATP7B外顯子缺失。有研究證實4%的患者存在ATP7B基因部分缺失[10]。對于1個致病突變的患者不排斥外顯子缺失或者基因檢測技術局限性為被檢出可能性。50例患者中共檢測出30個突變,其中比較常見的是c.2333G>T/p.Arg778Leu,c.2975C>T/p.Pro992Leu,c.2621C>T/p.Ala874Val,c.2755C>T/p.Arg919Trp,c.3316G>A/p.Val1106Ile,29子p.Arg778Leu突變患者全部合并p.Leu770Leu,p.Arg778Gln未合并p.Leu770Leu。有文獻報道[11]我國WD患者高頻突變為p.Arg778Leu、p.Pro992Leu、p.Thr935Met,本研究發現高頻突變為p.Arg778Leu、p.Pro992Leu、p.Ala874Val,這可能跟地域差異有關。WD在肝臟方面表現為急性肝炎、急性肝衰竭、慢性肝炎、肝硬化等多種形式,容易忽略的無癥狀患者及危重的肝衰竭患者,兒童或者青少年WD患者的最早期表現為輕到中度脂肪肝,還有部分患者無任何明顯的臨床癥狀[12]。ATP7B先證者同胞患病概率為1/4,ATP7B基因檢測可以作為一線篩查的方法[3],有9例WD患者有明確的同胞患病史,其它患者同胞檢測發現23例攜帶者,檢測出8種ATP7B突變,為WD的早期確診提供科學依據。部分攜帶者存在轉氨酶升高或銅藍蛋白異?，F象,臨床要密切隨訪,定期復查與肝臟損傷和神經系統受累相關的檢查,爭取做到盡早治療、個體化治療和終生治療。