POR基因敲除、回補及過表達LO2細胞株的構建及作為AFB1染毒模型的初步應用

王 琳,袁建林,繆 昌,馬玉晗,曹三杰,趙 勤,*

(1.四川農業大學 動物醫學院 豬病研究中心,四川 成都 611130; 2.農業農村部獸用藥物與獸醫診斷技術四川科學觀測站,四川 成都 611130)

細胞色素P450氧化還原酶(cytochrome P450 oxidoreductase),簡稱POR,或CPR、CYPOR、OR、NCPR、P450R等。POR最先是作為單個煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)特異性細胞色素C還原酶被發現的,是所有肝微粒體中細胞色素P450微粒體氧化酶系(cytochrome P450 monooxygenases, CYP450s)的唯一電子供體[1]。肝臟作為機體異生素代謝的主要器官,POR在其中發揮了不可替代的代謝作用。POR對多種代謝過程至關重要,參與由CYP450s催化的類固醇激素、藥物和異生素等代謝反應[2-3]。POR不僅可作為電子供體參與由CYP450s介導的異生素代謝,也是構成幾種加氧酶復合物的基本成分,包括血紅素氧化酶、鯊烯單加氧酶、7-脫氫膽固醇還原酶[4],在機體中發揮代謝作用。如Reczek等[5]進行了基于CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)的陽性選擇篩選,確定POR基因是百草枯誘導活性氧(ROS)產生的來源,是百草枯誘導細胞死亡所必需的代謝基因。POR還能直接介導一些致癌毒性物質的代謝和轉化,故已作為抗癌治療的目標。Pedersen等[6]也研究發現,POR是三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)的獨立預后生物標志物,評估POR的表達變化能夠更有效地對TNBC患者進行監測和治療。

黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)對肝毒性的損傷巨大,肝臟作為AFB1的靶器官,機體攝入AFB1后,經過CYP450s作用將AFB1代謝為AFB1-8,9-環氧化物(AFB1-8,9-epoxide,AFBO),繼而在體內與DNA、RNA和蛋白質等生物大分子結合形成DNA加合物,攻擊機體內的DNA等生物大分子,引發DNA損傷、細胞凋亡等毒效應,進而引起細胞惡變,引發機體腫瘤[7]。其中POR對CYP450s有重要的調控作用,在AFB1的代謝及毒性過程中發揮了至關重要的作用,但具體的毒性作用機制還需要作深入研究。人肝細胞LO2是目前研究AFB1導致肝毒性損傷的一種常用體外細胞模型[8],但POR基因在LO2細胞中的敲除、回補或過表達細胞系的研究還未見報道。為深入研究POR在AFB1所致肝毒性中的功能和作用,急需構建LO2 PORKO、LO2 PORCO、LO2 POROE等細胞系作為相關毒理研究的細胞模型。

目前CRISPR/Cas9技術在基因編輯領域已得到廣泛應用。在此之前,利用鋅指核酸酶 (ZFN)和轉錄激活因子樣效應核酸酶(TALEN)進行基因編輯是常見的手段[9]。相較于ZFN與TALEN的蛋白質引導DNA切割方法,CRISPR/Cas9基因編輯技術的兩個基本組件:靶向目標基因引導RNA和切割雙鏈DNA的Cas9內切酶,使得CRISPR/Cas9介導的基因編輯具有簡單、高效、低成本、高特異性等優點。

在采用 CRISPR/Cas9技術定點敲除LO2細胞中POR基因構建LO2 PORKO細胞株,以及采用同源重組技術構建重組質粒后經細胞轉染與篩選分別構建穩定的LO2 PORCO和LO2 POROE細胞株的基礎上,再用AFB1染毒處理各細胞株后觀察細胞形態變化及測定細胞存活率,以驗證LO2 PORKO、LO2 PORCO和LO2 POROE細胞株的增殖功能,為后續將其作為相關毒理研究細胞模型并深入開展POR基因功能的研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

293T及人肝細胞LO2株(均為ATCC來源)、lentiCRISPR v2質粒和pcDNA3.1(+)/myc-His B質粒等均由四川農業大學動物醫學院豬病研究中心保藏并提供;黃曲霉素B1(純度≥ 98%)購自上海麥克林生化科技股份有限公司;人源POR抗體和HRP標記山羊抗兔IgG (H+L)均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;GAPDH抗體購自Proteintech公司;無縫克隆試劑盒與增強型CCK-8試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組處理辦法

LO2細胞分為正常細胞對照組(細胞+DMEM培養液)和不同濃度的AFB1染毒組。AFB1需用二甲基亞砜(DMSO)溶解后配制成5 mmol·L-1的母液后,再用DMEM高糖培養液稀釋成不同濃度,并對細胞進行規定時間的染毒處理。

1.2.2POR基因編輯靶位點的選擇設計和sgRNA引物的合成

通過NCBI數據庫搜索人源POR基因序列(ID:5447),再通過CRISPR設計工具網站(http://chopchop.cbu.uib.no/)設計POR的sgRNA,在待選的sgRNA中選擇綜合排名靠前且預測無脫靶效應的2條sgRNA,它們均靶向同一外顯子exon5。故分別設計了靶向POR-exon5的2個sgRNA,sgRNA及相應引物序列如表1。預期在exon5靶位點之后的基因序列發生突變,使POR基因自sgRNA靶位點后氨基酸翻譯錯碼從而導致POR蛋白不能正常表達。

1.2.3 lentiCRISPR v2-sgRNA重組質粒的構建

取靶向POR基因的兩個sgRNA的引物,通過降落PCR退火,形成雙鏈DNA。取經BsmB I限制性內切酶線性化后的lentiCRISPR v2質粒,使用T4 DNA連接酶連接,16 ℃過夜,第2天進行轉化及克隆。使用lentiCRISPR v2通用引物對轉化后平板上菌落挑單,進行菌落PCR鑒定。擴大培養陽性菌落,交由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序鑒定。將測序正確菌落擴大,抽提質粒保存于-20 ℃備用。

1.2.4 慢病毒包裝和病毒感染

293T細胞密度達到80%～90%時將質粒lentiCRISPR v2-sgRNA、psPAX2和pMD2.G按比例(質量比10∶6∶3)混合,根據轉染試劑說明,將質粒與脂質體混合物進行轉染,36 h后收集細胞上清液,4 ℃保存。繼續培養24 h后收集全部細胞液,兩次收集的上清液離心并過濾后置于-80 ℃備用。使用凍存的慢病毒液(病毒液∶培養液體積比1∶1)感染LO2細胞,加入總濃度為8 μg·mL-1的Polybrene增加病毒感染效率。感染36 h后換液,使用嘌呤霉素(1.5 μg·mL-1)篩選14 d后獲得陽性細胞株。其間產生的廢棄物均無害化處理,統一回收。

1.2.5 LO2 PORKO單克隆細胞系的篩選

使用有限稀釋法均勻接種約50個陽性細胞至96孔細胞培養板中,培養約一周后,挑取單克隆細胞團至24孔板中,逐漸擴大培養。收集細胞,提取基因組DNA,利用表2中的引物進行擴增,PCR產物經過回收純化進行測序鑒定。

表2 POR基因敲除鑒定引物序列

1.2.6POR基因真核表達質粒的構建

POR目的片段的獲取:根據RNA抽提試劑盒的說明提取LO2細胞總RNA,隨后反轉錄獲取cDNA進行POR基因擴增。POR同源擴增引物序列見表3。擴增產物大小約為2 088 bp。取PCR擴增產物進行電泳分析。線性化載體的制備:提取載體pcDNA3.1(+)/myc-His B質粒,使用限制性內切酶XhoⅠ、HindⅢ對其進行雙酶切,切膠純化獲得線性化載體,保存備用。

表3 POR同源擴增引物序列

無縫克隆構建重組質粒:將擴增正確的POR基因PCR產物和線性化pcDNA3.1(+)/myc-His B載體,按片段∶載體摩爾比=5∶1的比例混合,加入2×Seamless Cloning Mix,終體積為10 μL,50 ℃連接30 min,隨后將重組連接產物進行轉化。使用pcDNA3.1(+)/myc-His B載體通用引物T7和BGH rev,對轉化后平板上菌落挑單,進行菌落PCR鑒定。擴大培養陽性菌落,抽提質粒交由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序鑒定。將測序正確的菌落擴大培養,抽提質粒備用。

1.2.7POR重組質粒轉染及篩選

依照Lipofectamine 3000試劑盒說明向LO2細胞及LO2 PORKO細胞中轉染重組質粒pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR。轉染48 h后,采用500 μg·mL-1遺傳霉素(G-418)對轉染后細胞進行抗性篩選,14 d為一個篩選周期,獲取穩定轉染的LO2 POROE、LO2 PORCO細胞系。

1.2.8 LO2 PORKO、LO2 PORCO、LO2 POROE細胞系的蛋白質印跡鑒定

收集野生型LO2、LO2 PORKO、LO2 PORCO及LO2 POROE細胞,分別提取總蛋白。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,然后轉印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,室溫封閉1 h后,使用POR(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶5 000稀釋)抗體孵育過夜,再用辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h后,用ECL發光法進行顯色并拍照。

1.2.9 AFB1染毒LO2細胞及IC50值測定

野生型LO2細胞按密度為每孔每100 μL 3×104個細胞接種。根據CCK-8試劑盒的檢測方法,設置6個試驗組,分別為4 μmol·L-1、8 μmol·L-1、16 μmol·L-1及32 μmol·L-1的AFB1染毒組,試劑孔組和對照孔組。每個組設定6個復孔,重復3次。處理24 h或48 h后測定D450,根據式(1)計算存活率,繪制劑量-效應曲線,并使用SPSS 27.0軟件計算IC值,為后續研究中確定合適的AFB1染毒濃度和時間提供依據。

細胞存活率(%)=

(1)

1.2.10 光鏡下細胞形態觀察

將野生型LO2、LO2 PORKO、LO2 PORCO及LO2 POROE細胞分別以每孔每2 mL含1×106個細胞的密度接種于6孔細胞培養板,融合度為90%時進行AFB1染毒,然后于光學顯微鏡下觀察各組細胞形態變化并拍照記錄。

1.2.11 AFB1染毒后細胞存活率測定

將野生型LO2、LO2 PORKO、LO2 PORCO、LO2 POROE細胞以每孔每100 μL含3×104個細胞的密度接種。參照1.2.9節中的分組辦法及確定的染毒條件進行染毒處理與細胞存活率檢測。

1.2.12 數據處理與統計分析方法

（1）評價主體多元化。參與課程考核評價活動的主體除了教師外，還應該包括學生、企業行業專家、課程研究學者、專職評價機構等人員。

采用GraphPad Prism 9.0與Microsoft Office 2016中Excel軟件進行數據統計分析及繪圖。所有統計數據均以平均值±標準差的形式呈現,根據需要采用t檢驗或雙因素方差分析(Two-way ANOVA)進行差異顯著性分析,P<0.05被認為差異有顯著性。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.000 1,ns表示P>0.05。

2 結果與分析

2.1 lentiCRISPR v2-sgRNA重組質粒的構建結果

lentiCRISPR v2質粒信息部分示意圖及sgRNA插入位置見圖1-A;兩條sgRNA序列,分別為sgRNA-1和sgRNA-2,其序列信息見圖1-B,序列末端“TGG”為PAM識別位點;lentiCRISPR v2-sgRNA重組質粒測序結果見圖1-C,其中v2-sgRNA-2結果為反義鏈序列(5′→3′)。

A,lentiCRISPR v2質粒信息部分示意圖及sgRNA插入位置;B,sgRNA序列及靶位點示意圖;C,lentiCRISPR v2-sgRNA重組質粒測序結果。A, lentiCRISPR v2 plasmid information partial schematic diagram and sgRNA insertion location; B, sgRNA sequence and target site diagram; C, lentiCRISPR v2-sgRNA recombinant plasmid sequencing results.

2.2 LO2 PORKO單克隆細胞株的鑒定

對分別采用sgRNA-1與sgRNA-2靶位點得到的LO2 PORKO單克隆細胞株進行測序鑒定,并與POR基因序列和靶序列進行比對。測序峰圖如圖2-A所示;圖2-B為序列比對結果。結果顯示:與LO2細胞相比,細胞株sgRNA-1-POR基因靶位點序列中第18位單堿基“T”敲除;而細胞株sgRNA-2-POR的基因靶位點序列的最后3個堿基發生突變(由“C”突變為“T”),而后導致靶位點后連續10個堿基(TGGTGGTTTT)敲除,編輯效率較靶位點sgRNA-1高。此后選取靶位點sgRNA-2的POR敲除細胞進一步檢測POR蛋白表達水平(圖4)。

A,LO2 PORKO細胞測序峰圖;B,LO2 PORKO細胞序列比對圖。A, LO2 PORKO cell sequencing peak map; B, LO2 PORKO cell sequence comparison map.

2.3 pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR重組質粒的構建

圖3-A為pcDNA3.1(+)/myc-His B質粒部分信息及POR目的片段插入位點示意圖;圖3-B為以LO2細胞cDNA為模板擴增的POR同源片段電泳結果,片段大小約為2 088 bp;圖3-C為重組質粒轉化后菌落PCR鑒定的電泳結果;圖3-D為陽性菌落測序峰圖及測序后與POR序列比對的結果。

A,pcDNA3.1(+)/myc-His B質粒部分信息示意圖及POR片段插入位點;B,以LO2細胞cDNA為模板擴增的POR同源片段,1為DNA marker,2為目的片段;C,菌落PCR鑒定電泳圖,1為DNA marker,2～4為陽性菌落;D,陽性菌落測序比對結果。A, pcDNA3.1(+)/myc-His B plasmid partial information schematica and insertion site of POR target fragment; B, POR homologous fragment amplified in LO2 cell cDNA as template,1 is DNA marker,2 is the target fragment; C, PCR electrophoretic map of colony identification, 1 is DNA marker, 2-4 is positive colony; D, Sequencing results of positive colonies.

2.4 LO2 PORKO、LO2 PORCO、LO2 POROE細胞系的蛋白質印跡鑒定

以野生型LO2細胞為對照,用蛋白質印跡(Western blot, WB)技術鑒定各細胞系中POR蛋白表達情況。GAPDH蛋白大小為36 ku。對于LO2 PORKO細胞,根據2.2節中所得測序結果,整理獲得野生型LO2細胞的POR序列及編輯后的序列,使用在線網站(http://www.bio-soft.net/sms/)對序列進行翻譯,得到氨基酸序列并比對(圖4)。POR靶位點處發生3個堿基的突變(C→T)及后續產生了10個堿基的缺失,導致了POR基因無法正常翻譯,自sgRNA靶位點后氨基酸翻譯錯碼,同源性極低,因此LO2 PORKO細胞泳道中未見蛋白條帶。pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR重組質粒由于其所帶myc與6×His標簽,經細胞轉染后表達的POR蛋白大小為80.4 ku,而內源性POR蛋白大小為77 ku。因此,LO2 PORCO細胞中POR蛋白條帶位置略高于野生型LO2細胞,LO2 POROE細胞泳道中則為80.4 ku與77 ku大小的POR蛋白同時存在。

以LO2細胞為對照,WB檢測LO2 PORKO、LO2 PORCO及LO2 POROE細胞中POR蛋白表達情況,并對LO2 PORKO細胞中氨基酸序列進行比對分析。With LO2 cells as the control, WB detected the expression of POR protein in LO2 PORKO, LO2 PORCO and LO2 POROE cells, and the amino acid sequences in LO2 PORKO cells were analyzed.

2.5 AFB1染毒LO2細胞后的IC50值

用4 μmol·L-1、8 μmol·L-1、16 μmol·L-1及32 μmol·L-1AFB1分別處理LO2細胞24 h及48 h后,與對照組相比,隨著AFB1濃度與作用時間的增加,LO2細胞存活率降低(圖5);表明AFB1染毒后會引起LO2細胞死亡,且LO2細胞存活率與AFB1呈染毒濃度及時間依賴關系。

圖5 AFB1對野生型LO2細胞劑量效應曲線Fig.5 The toxic dose-effect curve of AFB1on the relative cell viability of wild-type LO2 cell lines

AFB1處理LO2細胞后分析所得IC值見表4。24 h時IC50值為339.97 μmol·L-1;48 h時IC50值為4.28 μmol·L-1。根據試驗結果,在綜合考慮AFB1對LO2細胞有明顯的毒性效應,又保證細胞有一定的存活率且不采用過高的染毒濃度的情況下,后續實驗采用48 h時的近似IC50值(4 μmol·L-1)及2倍IC50值(8 μmol·L-1)的AFB1處理細胞48 h。

表4 IC值的統計結果

2.6 AFB1處理后的細胞形態

根據2.5節所確定的AFB1染毒濃度與時間,以0 μmol·L-1、4 μmol·L-1及8 μmol·L-1AFB1處理48 h后觀察細胞形態。如圖6所示,0 μmol·L-1AFB1處理后的野生型LO2細胞形態規則,大小均一,生長正常,只有少量細胞在無血清培養液中死亡后漂浮。而隨著AFB1濃度的升高,細胞形態改變,間隙擴大,數量與密度減少,貼壁性減弱;胞間連接逐漸消失變圓、空泡化、脫落等,有大量死亡細胞漂浮,與對照組相比變化明顯。LO2 POROE對照組細胞生長狀態良好,經AFB1處理后同樣出現形態改變、死亡及漂浮現象,貼壁細胞相較于同濃度下的野生型LO2細胞更少。而LO2 PORKO細胞在AFB1處理前后并無明顯差別,4 μmol·L-1與8 μmol·L-1AFB1處理組之間也無明顯變化。相較于LO2 PORKO細胞,LO2 PORCO在AFB1處理后死亡,呈濃度依賴性;但相比于野生型LO2細胞,同濃度下AFB1處理后的LO2 PORCO細胞死亡數量較少,貼壁細胞更多。結果表明POR基因能夠對AFB1在LO2細胞上的毒性產生影響,并再次證明LO2 PORKO、LO2 PORCO、LO2 POROE細胞構建成功。

圖6 AFB1作用48 h對細胞形態特征的影響(100×)Fig.6 Effect of morphological characteristics on cells after 48 h treated with AFB1under optical microsope (100×)

2.7 細胞存活率

AFB1處理48 h后野生型LO2、LO2 PORKO、LO2 PORCO及LO2 POROE細胞存活率。各濃度下不同細胞株組與各自陰性對照組比較,**,P<0.01;***,P<0.001;ns, P>0.05;各濃度下不同細胞株組與同等濃度AFB1作用下的LO2細胞組相比,*,P<0.05;**,P<0.01;****,P<0.000 1。The cell viability of LO2, LO2 PORKO, LO2 PORCO and POROE cells treated with AFB1for 48 hours. Different cell lines at different concentrations were compared with negative control groups, **, P<0.01; ***, P<0.001; ns, P>0.05. Compared with LO2 cell group under the same concentration of AFB1, *, P<0.05; **, P<0.01; ****, P<0.000 1.

各濃度下不同細胞株組與同等濃度AFB1作用下的LO2細胞組相比:相比于同等濃度AFB1作用下的野生型LO2細胞,LO2 PORKO細胞各濃度組細胞存活率均顯著高于野生型LO2細胞染毒組(P<0.000 1)。表明POR基因敲除后,AFB1對LO2細胞毒性作用減弱。而LO2 PORCO細胞存活率變化趨勢與野生型LO2細胞相同,但仍顯著高于野生型LO2細胞(P<0.05),表明POR基因回補后,LO2細胞經AFB1處理后致死的效應部分恢復。與同等濃度AFB1作用下的野生型LO2細胞相比,LO2 POROE細胞各濃度組細胞存活率均顯著降低。表明在LO2細胞中,POR基因確實參與了AFB1的肝細胞毒性效應,且POR的表達量與AFB1對LO2細胞的毒性作用呈正相關關系。

3 討論

為深入研究POR蛋白功能,近年來已有一些POR基因敲除的動物及細胞模型報道。動物模型中,可能是由于小鼠體內參與生物合成和代謝膽固醇的P450酶缺少電子轉移體,POR基因敲除的小鼠在胚胎期即致死,限制了在動物整體水平上對POR功能進行進一步的深入研究[10]。在細胞模型方面,目前已有報道的肝POR基因敲除細胞系包括人肝癌HepG2細胞[11-12]、小鼠肝癌細胞Hepa1c1c7[13]等,為肝臟異生素代謝的研究提供了材料。但常用于研究肝細胞癌代謝與治療的肝癌細胞系HepG2不僅在基因與蛋白表達方面不同于正常肝細胞系[14-15],在藥物及異生素代謝方面也存在相當大的差異[3,16-17]。在肝功能體外細胞研究中,選用正常肝細胞,如人肝細胞LO2比癌細胞株更能模擬體內環境,符合生理特點,能夠得到更為準確的數據,但POR基因在LO2細胞上的敲除模型尚未見報道。因此,選擇CRISPR/Cas9技術構建POR基因敲除LO2細胞株,對于研究POR在肝細胞中的功能具有重要意義。

目前CRISPR/Cas9技術已在堿基編輯、轉錄調控和表觀遺傳編輯、基因組規模篩選等方面得到廣泛應用[18-19]。同時,利用CRISPR/Cas9技術能夠實現許多應用,包括快速生成細胞和動物模型、功能基因組篩選和細胞基因組的實時成像[20]。如在體內動物模型和體外在體細胞和生殖系統細胞中成功調節致病等位基因,為臨床治療性基因組編輯作出貢獻[21]。目前已有許多應用CRISPR/Cas9技術對肝細胞進行基因編輯的研究報道:如耿夢雅等[22]利用CRISPR/Cas9技術敲除人肝臟細胞HL7702的Sidt2基因;Hendriks等[23]描述了在人類胎兒肝細胞中使用CRISPR/Cas9生成基因敲除細胞的方法;Lv等[24]在研究中使用了Nrf2基因敲除的HepG2肝癌細胞株;Lee等[25]利用CRISPR/Cas9下調了Huh7和Hep3B細胞株中的HGF基因。

本實驗利用CRISPR/Cas9技術構建敲除POR基因的LO2細胞,參考基因組信息,利用在線工具網站,對POR的15個外顯子序列進行sgRNA引物設計打分,選擇兩個綜合排名靠前的序列設計引物并構建慢病毒質粒,并預測無脫靶效應。在嘌呤霉素篩選陽性細胞后直接進行單克隆細胞篩選,后續再進行測序鑒定及蛋白質印跡法驗證敲除結果,極大地縮短了實驗周期和節省試劑耗材,并且蛋白水平上的變化更能反映POR的敲除效果。lentiCRISPR v2-sgRNA-2質粒經克隆測序及蛋白質印跡法鑒定顯示敲除效果較好,該組細胞的DNA與野生型LO2細胞對比,發生了3 bp堿基突變及靶位點后10 bp堿基敲除,導致POR基因無法正常轉錄,自sgRNA靶位點后氨基酸翻譯錯碼,POR蛋白不能正常表達,POR抗體難以識別。說明sgRNA-2精準靶向了POR基因,在基因及蛋白水平上均實現了POR的成功敲除,成功構建了POR敲除LO2細胞模型。此外,相較于條件敲除小鼠模型,利用CRISPR/Cas9技術構建POR敲除的LO2細胞體外模型,更符合“3R”(減少Reduction、替代Replacement、優化Refinement)原則,且排除了其他哺乳動物與人體的反應差異問題,得到的結果更為科學客觀[26]。

在基因敲除的基礎上,基因回補在理論上能夠恢復由基因敲除帶來的表型變化,基因過表達則能正向驗證基因的功能,進行某種基因的回補及過表達細胞株的構建,對深入研究該基因的功能至關重要。在成功構建LO2 PORKO細胞株的基礎上,通過同源重組法構建pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR重組質粒,轉染至LO2及LO2 PORKO細胞株中,經G-418篩選及蛋白質印跡法檢測POR蛋白表達水平,得到穩定表達POR重組蛋白的LO2 PORCO及LO2 POROE細胞株。pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR重組蛋白因pcDNA3.1(+)/myc-His B載體所帶myc及6×His等標簽,其蛋白大小(80.4 ku)比LO2野生型細胞中POR蛋白(77 ku)大3.4 ku。蛋白質印跡法結果表明,POR蛋白成功回補進LO2 PORKO細胞中,蛋白大小與預期相符合;POR蛋白在LO2細胞中成功過表達,說明LO2 PORCO及LO2 POROE細胞系均構建成功。

AFB1作為被國際癌癥研究機構(IARC)列入的Ⅰ類致癌物,與癌細胞的增殖和侵襲密切相關[27]。已有的證據表明,肝臟是AFB1毒性和生物轉化的主要場所,AFB1對機體的損傷主要集中在肝臟,可導致肝臟急性或慢性肝細胞損傷[28]。AFB1的毒性作用和致癌作用與其經代謝活化形成活性中間代謝產物AFBO有關,而其在體內代謝活化過程中最主要的代謝酶CYP450s活性的發揮需要POR、NADPH等輔酶為其提供電子,顯示出POR對AFB1的細胞毒性作用有十分重要的影響。因此,以AFB1為例,測定AFB1處理后的POR基因敲除、回補及過表達的LO2細胞存活率變化以驗證各細胞株的增殖功能,能夠為更多致肝毒性相關的毒理研究提供細胞模型。

選取4 μmol·L-1、8 μmol·L-1、16 μmol·L-1及32 μmol·L-1AFB1分別處理LO2細胞24 h及48 h,測定AFB1對LO2細胞的劑量效應關系。結果表明,AFB1對LO2細胞具有明顯的毒性效應,且LO2細胞存活率隨著AFB1作用濃度與作用時間的增加而降低。這符合Liu等[29]及Zhu等[30]對AFB1在LO2細胞上的毒性研究結果。但不同濃度AFB1作用48 h時細胞存活率變化比24 h時更明顯,計算發現24 h時AFB1的IC50值(339.97 μmol·L-1)也遠高于AFB1處理48 h時(4.28 μmol·L-1),這與Pauletto等[31]在牛胎肝細胞衍生細胞系 (BFH12)中對AFB1的IC50值測定結果一致,即暴露于濃度不斷增加的AFB124 h的細胞表現出較低的死亡率,而處理48 h后BFH12細胞的IC50值為6.34 μmol·L-1。因此,根據IC值測定的結果,選取了AFB1濃度4 μmol·L-1及8 μmol·L-1,作用時間48 h進行后續試驗。

細胞形態觀察結果發現,LO2細胞經AFB1處理后變形、脫落、死亡并漂浮。LO2 PORKO細胞形態在AFB1染毒前后并未觀察到明顯變化,初步判定POR基因參與AFB1對LO2細胞的毒性作用,且POR基因與AFB1毒性效應存在正相關關系,隨后對LO2 PORCO及LO2 POROE細胞的形態觀察結果也表明了這一點。各細胞株AFB1處理后存活率變化與形態觀察的結果相符合:野生型LO2細胞存活率隨AFB1濃度增加而降低;LO2 PORKO細胞在4 μmol·L-1及8 μmol·L-1AFB1處理后存活率與對照組相比無顯著差異(P>0.05);LO2 POROE細胞存活率變化趨勢與野生型LO2細胞一致,隨AFB1濃度的增加而降低,但其細胞存活率比同濃度下野生型LO2細胞更低,這可能是由于POR蛋白過表達后進一步促進了AFB1對LO2細胞的毒性作用;LO2 PORCO細胞存活率變化趨勢也與野生型LO2細胞一致,表明POR基因回補后恢復了基因敲除帶來的AFB1對LO2細胞毒性的表型變化,但其存活率仍顯著高于野生型LO2細胞(4 μmol·L-1時P<0.000 1,8 μmol·L-1時P<0.01),這可能是因為LO2 PORCO細胞中POR蛋白的回補表達量未達到野生型LO2細胞水平所致,這也顯示了POR基因對AFB1所致細胞毒性的影響巨大。

總之,鑒于POR在參與由細胞色素P450蛋白催化的類固醇激素、藥物和異生素代謝反應方面的重要作用,LO2 PORKO、LO2 PORCO、LO2 POROE細胞株的成功構建及AFB1對各細胞株的增殖功能驗證,有望為POR基因功能及更多致肝毒性風險因素相關研究的開展提供必備的細胞模型。

4 結論

本實驗采用CRISPR/Cas9基因編輯技術成功敲除LO2細胞中的POR基因,構建LO2 PORKO細胞株;并通過同源重組方法構建了真核表達質粒pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR,經轉染篩選后分別建立了LO2 PORCO及LO2 POROE細胞株;最后以AFB1處理各細胞株,通過檢測細胞存活率和細胞形態的變化初步驗證POR基因在AFB1所致LO2細胞毒性中的影響,為后續LO2 PORKO、LO2 PORCO、LO2 POROE細胞株作為相關毒理研究細胞模型并深入開展POR基因功能的研究提供了相應的生物材料。