白芥子穴位給藥配伍對延胡索乙素藥效動力學影響的研究

高 遠 李 冀 韓東衛 周夢丹

(1 貴州中醫藥大學藥學院,貴陽,550025; 2 黑龍江中醫藥大學,哈爾濱,150040; 3 貴州醫科大學附屬醫院針灸科,貴陽,550001)

“冬病夏治”方源于張璐《張氏醫通》中“冷哮方”,中國針灸學會制定的《“冬病夏治穴位貼敷”療法臨床應用指導意見(草案)》指出:該方以白芥子、延胡索、甘遂、細辛、生姜為基本處方,現代臨床在此基礎上進行加減[1]。該方以白芥子、延胡索為君藥,其中白芥子作用尤其特殊。元代朱震亨曰:“痰在脅下,非白芥子不能達?！眳前矘I在《理瀹駢文》中強調“白芥子外敷,雖熱勿揭,正是拔動病根”,可見白芥子深入、長效的獨特作用。透皮試驗表明,白芥子能夠有效促進方中其他藥物經皮滲透,起到透皮吸收促進劑的作用[2-3]。以上古代醫家的經驗、現代研究均提示,該方中白芥子不但有藥理作用,還可能有一定的附加藥物作用。而白芥子的獨特作用是否會影響方中其他藥物的體內轉運,起到整體增效作用,需要對方中主要藥物的分布情況進一步研究。

中藥經皮吸收后,還需要經過體內分布、代謝、排泄的過程,且一直處于動態變化中,產生綜合性治療作用[4]。藥代動力學-藥效動力學(Pharmacokinetics-pharmacodynamics,PK-PD)模型是結合藥物體內行為和藥效作用,同時闡述劑量、時間、效應三者之間關系的體內研究方法[5-6]。本文以PK-PD數學擬合的方式,將“肺俞”穴皮下部位建立為抽象“房室模型”,描述該部位藥效隨著劑量變化的動態規律。通過構建虛擬的PK-PD“房室”,比較白芥子配伍前后,方中君藥延胡索主要成分在穴位局部的動態變化規律,探討其配伍的獨特作用,為探索經典方劑立法的科學內涵,找尋外用復方配伍規律提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 新西蘭家兔24只,14～21周齡,體質量1.5～2.0 kg,雌雄各半,購自黑龍江中醫藥大學實驗動物中心[許可證號SYXK(黑)2021-005,經黑龍江中醫藥大學實驗動物管理和使用委員會批準,審批號:2021042201],飼養條件為溫度20～25 ℃、濕度(45±5)%、12 h光照,飼養1周后進行造模,取材前禁食24 h。

1.1.2 藥物 白芥子飲片、延胡索飲片、甘遂飲片、細辛飲片、生姜飲片購自黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院,經鑒定為地道藥材,粉碎為細粉,臨用前配制。

1.1.3 試劑與儀器 弗氏完全佐劑(Sigma公司,美國,貨號:SLCC73365);戊巴比妥鈉(Sigma-Aldrich公司,美國,批號:貨號:F200550);兔IgE酶聯免疫吸附試驗檢測試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司,貨號:SP10179);液相質譜聯用色譜儀(沃特世科技有限公司,美國,型號:UPLC-TOD型H-Class e2695);色譜柱(沃特世科技有限公司,美國,型號:AC.UPLC HSS T3 2.1 mm×75 mm 1.8 μm);雙通道微透析注射泵(CMA公司,瑞士,型號:CMA 402 Syringe Pump);4 mm微透析探針(CMA公司,瑞士,型號:CMA20Elite);雙通道灌注器(CMA公司,瑞士,型號:CMA 1.0 mL);全功能酶標儀(伯騰儀器有限公司,美國,型號:Synergy H1);高速冷凍離心機(Eppendorf股份公司,德國,型號:5424R)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 以1.2 mL/kg劑量注射10%卵蛋白溶液,作為首次致敏,14 d后置于一密閉容器內,1%卵蛋白、弗氏完全佐劑生理鹽水溶液霧化激發至出現腹肌抽搐、煩躁、唇鼻發紺、二便失禁等現象,連續7 d則造模完成。隨機分為延胡索單方組、缺白芥子組、全方組,每組8只。

1.2.2 穴位貼敷干預方法 按處方比例取白芥子、細辛、甘遂、延胡索、麻黃、黃芩(2∶2∶1∶2∶1∶1)的藥材細粉共10 g,混合均勻,姜汁調增加黏性,成2 cm×2 cm大小的穴位貼,取家兔背部“肺俞”穴位(所選穴位為《張氏醫通》記載),于模型家兔背部第3胸椎棘突下旁開1.5 cm處貼敷給藥。延胡索單方組給予處方劑量延胡索(0.22 g)進行穴位貼敷;全方組按照處方穴位貼敷給藥;缺白芥子組按照處方排除白芥子進行穴位貼敷給藥。

1.2.3 檢測指標與方法 1)延胡索乙素關節腔微透析采集方法的建立:CMA20微透析探針植入模型家兔背部“肺俞”穴皮下,2 μL/min流速,持續收集30 min的透析液作為該時間點的到的樣本。于給藥后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14 h(14 h內透析探針具有良好的回收率)收集透析液,得到的透析液加入150 μL氯仿溶液,離心取下層溶液120 μL,蒸干氯仿后用甲醇50 μL復溶待檢測。2)延胡索乙素超高效液相色譜法的建立:a.色譜條件,色譜柱ACQUITY UPLC HSS(2.1 mm×75 mm 1.8 μm);流動相甲醇-0.1%甲酸水(62∶38三乙醇胺至pH=6);體積流量0.3 mL/min;檢測波長280 nm;進樣體積2 μL。b.質譜條件,離子源為電噴霧離子;毛細管電壓2.8 kV;去溶劑氣溫度350 ℃;氮氣流速650 L/h;撞擊能量40 eV;母離子→子離子對質荷比(m/z)356.59→191.44。c.線性范圍測定,精密稱取延胡索乙素對照品2.5 mg,置于25 mL容量瓶中,甲醇定容,得到對照品母液,甲醇稀釋制備成100,200,400,1 000,2 000,10 000 ng/mL系列對照品溶液。d.專屬性試驗,制備空白透析液,微孔濾膜過濾。e.準確度與精密度試驗,精密稱取100、400、10 000 ng/mL對照品溶液,平行進樣6次。f.加樣會收率試驗,精密稱取延胡索乙素對照品,配制成100、400、10 000 ng/mL溶液,每個質量濃度3份,測得平均加樣回收率。3)藥效學樣本采集及檢測:2%的戊巴比妥鈉麻醉模型動物,左側頸靜脈,插管后分別于給藥后0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14 h(與PK-PD取樣時間相對應)頸靜脈處采血1 mL,每次采血后及時補充1 mL生理鹽水和1 mL肝素鈉。以3 000 r/min(離心半徑60 cm)離心血樣20 min,收集上清液,酶聯免疫吸附試驗法測定IgE含量。

1.3 PK-PD模型擬合及統計學方法 SPSS 20.0統計軟件對實驗數據進行分析,組間比較采用兩兩配對t檢驗分析,以P<0.05為差異有統計學意義。WinNonlin 5.2軟件進行智能化分析,以赤池信息量準則(Akaike Information Criterion,AIC)值越小、殘差平方和值越小、擬合度值越大則模型擬合越好的原則判斷房室模型。以延胡索乙素濃度為藥動學指標,為PK-PD數學模型提供驅動因素PK input,以IgE的抑制率為PK-PD模型提供計算藥效替代指標PD endpoint,繪制“濃度-時間-效應”三維曲線圖。

WinNonlin 5.2軟件計算藥動學參數,測定達峰時間(Tmax)、藥峰濃度(Cmax)、藥時曲線下面積(AUC0-t)、平均滯留時間。

得到的藥代動力學參數,以時間-效應室濃度繪制到時間-PK關系;得到的藥效學參數,以時間-效應繪制時間-PD關系,進行PK-PD模型擬合,獲得效應室藥物濃度、對應時間、藥效三者(C-t-E)關系圖、抑制率-藥物濃度的逆時針曲線圖。

2 結果

2.1 延胡索乙素測定方法建立的結果 得到回歸方程Y=9 567.4X-5 422.4(R=0.999 87),在1～100 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系;色譜峰型良好,出峰位置無干擾,專屬性良好;相對標準偏差(Relative Standard Deviation,RSD)分別為1.57%、1.05%、0.95%,表明儀器精密度良好;平均加樣回收率為98.59%,RSD為1.22%。

2.2 藥動學結果 結果最匹配的藥動學模型為血管外給藥的一房室模型。與缺白芥子組比較,全方組達峰時間(Tmax)更短(P<0.01),藥峰濃度(Cmax)更高(P<0.01)、AUC0-t增大(P<0.01)、平均滯留時間延長(P<0.05)。見表1。與缺白芥子組比較,全方組藥物在血液中出現更早,消退更緩慢。見圖1。

表1 穴位給藥后各組延胡索乙素的藥動學參數

圖1 白芥子配伍前后模型家兔體內藥-時關系圖

2.3 藥效學結果 與延胡索單方組比較0～0.5 h無差異,1～3 h差異有統計學意義(P<0.05),4～14 h差異有統計學意義(P<0.01)。與缺白芥子組比較,全方組0～1 h差異無統計學意義,1～3 h差異有統計學意義(P<0.05),4～14 h差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。藥物與效應擬合度較好,參數見表3。

表2 穴位給藥后各組血清中IgE相對表達量

表3 穴位給藥后各組延胡索乙素的PK-PD參數

2.4 PK-PD模型擬合結果 從濃度-時間-效應三維曲線圖來看,延胡索單方組、缺白芥子組,藥物濃度-效價重合度顯著高于全方組;從抑制率-濃度曲線圖來看,全方組的逆時針趨勢顯著高于延胡索單方組、缺白芥子組。見圖2。

圖2 白芥子配伍前后濃度-時間-效應三維曲線圖、抑制率-濃度曲線圖

2.5 小結 藥動學結果表明,白芥子配伍可以增加延胡索乙素吸收,提高生物利用度。分析原因,可能與白芥子配伍后,改變了延胡索乙素體內吸收、分布有關。

藥效學結果表明,白芥子配伍后對IgE抑制作用更明顯。分析原因,可能是白芥子配伍后,改善了延胡索乙素體內過程,進而增加療效。

PK-PD模型擬合結果表明,白芥子配伍后藥物濃度與藥效時間上并不是嚴格一一對應的。穴位處藥物濃度下降期間,藥效仍能夠保持較高的水平甚至逐漸達到效應峰值。這一趨勢表明,白芥子配伍后存在一定藥效滯后現象,藥物作用的效應室不實際存在,經PK-PD數學模型形成抽象的虛擬效應室。

PK-PD模型擬合結果的抑制率-濃度曲線圖趨勢表明,各組均屬于逆時針曲線,藥效滯后于藥物濃度變化,從效應室到靶向部位的傳遞屬于階段過程。白芥子配伍后的逆時針趨勢更明顯,(虛擬的)效應室濃度與(局部的)關節腔濃度是完全不重合的兩條逆時針曲線,結合參數Ke0值可以發現(白芥子配伍后,Ke0降低):白芥子配伍后,延胡索乙素在效應室和靶器官之間平衡速度降低,從效應室的消除速度降低,更加長時間滯留在(虛擬的)效應室、作用于穴位,更長時間刺激穴位,產生持久的藥效作用,推測這是白芥子配伍后藥效得到放大的原因。

3 討論

一直以來,經典方劑立法意圖、組方規律的科學內涵應該如何體現,都是中藥復方現代化研究的焦點、難點問題[7-10]?！岸∠闹巍狈阶鳛閼弥两竦耐庥媒浀浞絼?必有其深刻的科學內涵需要挖掘?，F代醫家從藥性理論、治法功效進行分析,認為該方辛溫助陽、散寒止痛,適合外寒侵襲引發的哮喘[11-12]。但是僅從配伍關系、臨床功效進行分析,并不全面。清代·張璐在創立此方時便認識到“該方涂后麻痹痛、切勿輕易便去”,可見此方在臨床使用時需要長時間用藥,使其緩緩發揮藥效。本研究發現,這種長時間用藥的緩慢、滯后效果與白芥子的使用有一定相關性,能幫助方中延胡索有效成分滯留穴位部位時間更長、持續發揮藥效,在方劑中起到藥效、改善藥物穴位皮下分布的雙重作用。

目前,中藥復方配伍規律的研究主要從化學組成、藥理學方面進行研究,近年來已經有研究者從藥物動力學角度對經典方劑進行重新認識。倪建新等[13]研究左金丸的配伍規律發現,吳茱萸配伍后,黃連中主要成分小檗堿半衰期延長,達峰時間Tmax、峰濃度、AUC等藥動學參數都呈現生物利用度優勢。王天明等[14]研究發現,甘草和冰片配伍使用可增加甘草苷AUC0-∞、延長t1/2、縮短達峰時間Tmax。李燕等[16]發現,附子總生物堿與大黃蒽醌配伍后,附子總生物堿的指標性成分在模型大鼠體內的總入血量更大、代謝更快。米雅慧等[17]發現川芎天麻配伍后,川芎中川芎嗪、阿魏酸在大鼠腦內吸收程度增加,作用時間延長,消除速度降低,腦內蓄積量顯著增加。李蕓霞和彭成[18]對現有的中藥附子復方研究進行整理后,認為附子在不同處方中藥動學參數有明顯差異,對于配伍后附子毒性研究有指導意義。

本研究在以上藥動學研究基礎上,結合PK-PD模型,對經典方劑配伍的科學性進行探索。PK-PD模型能夠將PK和PD整合一體,完成藥量和效應之間的轉換,將釋藥體系看成一個抽象的整體,用數學方式模擬藥物體內吸收-積累-起效的全過程[19-20]。而中藥復方的整體性特征,恰恰可以視為一種釋藥體系,相當于現代藥劑學概念中的給藥系統[21-22]。特別對于穴位部位這種解剖學難以定位的部位,采用PK-PD數學模型擬合的建立虛擬的藥動學“房室”,可以幫助我們更好地闡述藥物在穴位部位分布、轉運、代謝的過程。因此,以藥動學研究為基礎,結合PK-PD數學模型,比較配伍前后的變化,闡明穴位用藥配伍的科學內涵是一種新探索,也是追溯中藥復方配伍協同作用、找尋中藥經典方劑遣方用藥規律的新思路。

利益沖突聲明:無。