金花葵中黃酮的提取及純化研究進展

賈 娟，陳 品，王婷婷，李艷秋

（1.河南工業大學漯河工學院，河南 漯河 462002；2.漯河職業技術學院，河南 漯河 462002；3.合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230601）

金花葵是一年生植物，隸屬于錦葵科黃秋葵屬，被稱為“菜芙蓉”和“植物界的熊貓”[1]?！俄樀赂尽分杏涊d金花葵在明朝就已經存在，2003 年中國農業科學研究院再次在河北邢臺地區發現了金花葵。金花葵自然分布在河北地區，仿野生金花葵大量種植在河南、河北地區。金花葵喜歡溫暖、陽光充足的地方，耐高熱，耐嚴寒，對土壤的要求也不是很苛刻，因此除了在極寒地區不能很好地生長以外，在其他地區都可以種植。

金花葵的花無毒，具有祛濕熱、消炎、鎮痛的作用；果實和籽也是寶，具有保護脾胃、提高食欲和治療跌打損傷等作用[2]。金花葵具有較高的藥用價值，含有很多營養成分，如生育酚、多糖膠、微量元素、纖維素等。此外，金花葵含有較高的黃酮類化合物。隨著國內外研究的不斷深入，發現黃酮類化合物具有抗衰老、抗氧化、鎮痛、抗突變、抑制腫瘤細胞等功能，越來越受到人們的重視和認可，這類化合物被廣泛的應用于食品、藥品、化妝品等行業[3-4]。因此，對黃酮類化合物的提取、純化與應用已經成為醫藥、食品、生物工程等領域的重要課題。本文就近10 年來國內外學者對黃酮類化合物的提取分離純化方法進行綜述，旨在為合理開發利用金花葵資源，為黃酮類產品的開發提供一定的理論參考依據。

1 金花葵黃酮提取方法

1.1 超聲波輔助提取法

超聲輔助提取主要利用空化效應來破壞植物細胞，使溶劑滲透到植物細胞中，從而在短時間內把黃酮類化合物提取出來，提取時間短，溫度低，雜質少，適用范圍廣[4-5]。宋琳琳等[5]利用超聲波輔助提取工藝提取金花葵黃酮，最佳提取條件為乙醇濃度80%、液料比25∶1、提取時間35 min，提取率為8.47%。申利英等[6]利用響應面法對超聲波輔助提取金花葵中黃酮進行了研究，在提取溫度31.97 ℃、乙醇濃度50.56%、料液比1∶21.22、提取時間31.92 min 的條件下，得到金花葵中黃酮的提取率為50.52%。周宇涵等[7]采用響應面法優化超聲提取金花葵總黃酮，最佳工藝為乙醇濃度75%，浸泡時間2.1 h，顆粒大小為45 目，總黃酮提取率的預測值為18.64%，實測平均值為18.03%。賈娟等[8]采用超聲波提取法提取金花葵莖部黃酮，最佳提取工藝為液料比為30∶1（mL/g），乙醇濃度40%，時間20 min，pH5.0，提取1 次，此條件下粗黃酮得率為1.15%。超聲波提取法是提取金花葵黃酮最常用的方法，主要原因是超聲波提取法作為一種較為溫和的提取方法對目標化合物成分的影響較??；同時，采用不同的條件提取黃酮，對黃酮類化合物提取率的影響也大不相同，由此可見，超聲波對黃酮類化合物的提取仍有較大優化空間。

1.2 微波輔助提取法

微波輔助萃取是使用微波技術來進行萃取，微波輔助主要使用其熱效應。因為含有水和極性有效成分的植物細胞在微波場中吸收了大量的熱量，因而產生內部熱效應使提取物的細胞結構分解，細胞外的溶劑很容易進入細胞內部溶解和釋放胞內物質。微波輔助提取具有快速高效、加熱均勻和操作簡單的特點，是常用的提取手段的一種[9-10]。Qiu[11]采用微波輔助法提取金花葵花中黃酮，最佳工藝為乙醇濃度70%、提取時間30 s、微波功率360 W、料液比1∶50、顆粒度小于80 目，此時黃酮提取率為5.673%。提取溫度和提取時間是微波提取法相對重要的因素，在劇烈的物理因素作用下，提取時間的微小差異都會影響實驗結果；微波提取效果和等效擴散系數直接聯系，因此對于不同物質狀態的原料要選用合適的料液比，以得到相對最優的等效擴散系數。

1.3 索氏提取法

金花葵花中黃酮用索氏提取法進行提取效果也較好。索氏提取器最初被用來提取牛奶中的脂類化合物，后來多被用來提取植物中的黃酮，主要運用溶劑回流和虹吸原理進行萃取。索氏提取法具有較好的選擇性、能耗低、操作簡單等優點，但是相比較微波提取和超聲波提取，需要較長的提取時間[12-13]。張路等[14]用索氏提取法提取金花葵的根中的總黃酮，通過正交試驗進行工藝優化，得出最佳提取工藝條件為乙醇濃度60%，料液比1∶35，在80 ℃的溫度下提取3 h，在此條件下黃酮的提取率可達到4.55%。索氏提取法的最大缺點是耗時較長，且對于不同形態結構的樣品，提取條件不同，提取效果差異也會較大。

1.4 超高壓提取法

超高壓提取技術是一種先進的提取技術，常溫下將100～1 000 MPa 的流體靜壓力作用于反應體系，使植物細胞內外產生較大的壓差，細胞壁發生破裂，使細胞中的物質得到充分釋放，從而促進物質轉移至提取溶劑中的方法，由于提取溫度低、提取時間短，故對有效成分破壞小，此方法具有健康、環保等優點，近年來，在植物活性成分的提取方面得到應用[15]。王雪竹等[16]通過響應面法優化金花葵總黃酮超高壓提取的工藝條件，得出在壓力400 MPa、提取時間4.5 min、乙醇濃度80%的條件下，總黃酮得率達到145.32 mg/g。佘迪等[17]通過響應面法優化超高壓提取金花葵根部黃酮的工藝條件，在壓力400 MPa、保壓時間8.3 min、乙醇體積分數70%優化條件下，黃酮得率為（3.87±0.13）%。與其他提取技術相比，超高壓提取技術有無可比擬的優勢，由于可在常溫下進行操作，對熱不穩定的提取物有一定的保護作用，得率相對較高。此外，超高壓提取不產生廢料，符合綠色環保的趨勢，具有十分廣闊的應用前景。

2 金花葵黃酮純化方法

2.1 大孔吸附樹脂法

大孔樹脂是一種有機高聚物吸附劑且具有很好的吸附功能和穩定性，對不同物質的吸附性與樹脂的極性有關，利用這一特點可以有效地將所需的有效成分提取出來。大孔樹脂吸附工藝是分離純化黃酮類化合物最常用的一種方法，穩定性、選擇性好[18-19]。王蕾等[20]為研究分離純化金花葵莖葉中總黃酮的最佳條件，選擇LX-J 系列、DM130、D101、AB-8 等10 種大孔樹脂，以金花葵莖葉中總黃酮的含量為參考指標，篩選出其中最優樹脂，通過試驗得到了最佳純化條件，即樣液濃度3 mg/mL，pH值5.0，吸附流速3 BV/h，過柱次數3 次，70%乙醇的洗脫速率4 BV/h 的條件下，LX-J24 大孔樹脂對總黃酮的吸附與解吸效果均為最佳，金花葵莖葉中總黃酮的含量提取率為78.06%，純度高達57%。張月琴[21]利用AB-8 大孔樹脂對金花葵總黃酮提取物進行純化，去除水溶性雜質,金花葵黃酮含量增高,洗脫液真空濃縮后,經冷凍干燥后得到黃棕色粉末。

2.2 膜分離法

膜分離法是選擇具有分離功能的天然或合成的膜材料作為分離介質，在濃度差、壓力差或電位差等作用下，將不同分子量區段組分分離、純化、濃縮的新型分離技術。這種方法可以在常溫下進行，保護有效成分、樣本量大、操作簡單、能耗低、廣泛的應用在醫藥和食品工業中[22]。目前膜分離技術在金花葵的分離純化上未見報道，但隨著膜分離技術的發展，分離純化的特點明顯，優勢顯著，膜分離技術越來越受到大家的重視，尤其在植物的分離純化中應用前景好，金花葵黃酮的分離純化可以參照其在其他物質上的應用，如滕春麗[23]利用HPS-100 超濾膜分離技術對紅托竹蓀多糖進行分離純化，將多糖含量提升至71.73%。羅愛勤等[24]采用膜分離法制備靈芝孢子多糖得率高于醇沉法，為（4.61±0.28）%；LI 等[25]采用截留不同相對分子質量的2 個納濾膜，從大豆發酵液中分離純化低聚糖，得率83.2%，多糖含量77.9%。Cai 等[26]將微濾、超濾、納濾膜集成膜分離系統，從猴頭菌中分離粗寡糖，得率14.8%，寡糖含量63.7%。

2.3 高速逆流色譜技術

高速逆流色譜技術又稱為離心分配色譜、液-液分配色譜，是一種兩互不相溶的液體體系分別作為固定相和流動相，進行續有效液液分離，溶質在兩相中分配分離的色譜技術。這種分離提純技術為可逆吸附、樣品損失小、提高了回收率、分離速度快、降低成本等特點，在生物制藥、活性成分分離等方面具有較大應用價值[27-29]。目前高速逆流色譜技術在金花葵的分離提純上未見報道，但因其提純物純凈、制備量大、技術成本低等優點，正在發展成為一種備受關注的新型液液分配色譜分離純化技術，廣泛應用于天然藥物有效成分的分離，制備金花葵黃酮的分離純化可以參考其他的物質上的應用，如姜姣姣等[30]以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5∶5∶3∶7，V/V/V/V）為溶劑系統，采用高速逆流色譜技術對藜蘆中的甾體類生物堿進行分離鑒定，藜蘆酰棋盤花胺和介芬胺的純度分別為91.34%、98.10%。尹雪蓮[31]以正己烷-甲醇-水（14∶7∶0.06，V/V/V）分離體系，采用高速逆流色譜法對乙酯型鳀魚油進行分離提純棕櫚油酸，含量為70.57%，純度可達（94.89±0.68）%。宋道光等[32]以正己烷/正丁醇/水/冰乙酸（系統I：1∶2∶1∶0.1，V/V/V 和系統II：1∶1∶1∶0.1，V/V/V/V）為溶劑系統，從小葉金錢草中分離四種黃酮苷類化合物,其純度均大于95%。吳雪[33]采用30%磷酸二氫鈉-乙醇-丙酮（6∶2∶1.5，V/V/V）為溶劑體系，通過高速逆流色譜法，分離麥芽糖基-β-環糊精，并鑒定其純度，其最高純度為93.2%。

3 金花葵黃酮測定方法

3.1 分光光度法

分光光度法經常被用來測定樣品中的黃酮含量，它需要在一定的波長范圍中測定吸光度，方法簡便，靈敏度高。使用分光光度法測定黃酮含量時，需要先確定黃酮的吸收波長，然后在這個波長下使用分光光度計來得到樣品的吸光值，使用蘆丁作為標準品得到回歸方程，然后根據回歸方程計算出黃酮含量。分光光度法操作簡單，但是速度快，準確度相對不高。曹東怡等[34]利用分光光度法在508 nm 下測定不同部位金花葵黃酮含量，其中花中總黃酮含量最高，達22 299.62 μg/g，其余部位（種子、果皮、莖、根）總黃酮含量均低于4 000.00 μg/g。張曉嬌等[35]利用分光光度計法（測定波長510 nm）對金花葵花冠中黃酮含量進行了測定，其黃酮含量為（43.23±0.56）mg/g。

3.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在完成各成分的分離之后，進入檢測器檢測的方法，分析速度快，一般情況下15～30 min就可以分析一個樣品，適用范圍廣，且對于熱穩定性比較差的化合物的分析也有一定的優勢。吳正超等[36]利用高效液相色譜法對金花葵中黃酮類物質進行了定量分析，得到平均加標回收率為95.20%～109.48%，RSD 小于2.24%，表明該方法檢測準確且精密度較好，可實現金花葵花黃酮類成分快速鑒定，為其藥效物質基礎及質量控制研究提供依據。高效液相色譜法效率高、靈敏度高，但是分析成本高。在進行黃酮含量測定時，可以根據實際情況選擇測定方法。

4 展望

金花葵中含有大量的黃酮類化合物，具有較高的營養和開發價值。對提取及純化金花葵中的黃酮進行研究，有利于更好地利用金花葵資源，服務地方經濟。黃酮的提取工藝還有很多，如酶輔助提取技術、超臨界萃取技術。酶輔助提取技術是一種利用酶來提取物質的一種工藝，酶可以有效地分解植物組織并保留提取物中的有效成分，因此可以用酶來輔助提取。酶輔助提取法可以軟化植物細胞壁使有效成分流出，從而提升提取率，通?？梢允褂美w維素酶、果膠酶等酶來進行提取，這種工藝很適合用來提取植物中的成分；同時，酶輔助提取工藝不僅操作簡便而且比較環保，是提取工藝的研究熱點[37]。使用酶輔助提取工藝提取金花葵中黃酮的研究還比較少，這種方法目前多被應用在其它天然植物活性成分的提取上，它的提取效果也很好，可以使用這種方法來提取金花葵中黃酮。超臨界萃取技術以超臨界流體為萃取劑，把萃取物從混合物中分離出來，具有安全性高、萃取速度快能耗低等特點。高壓脈沖電場技術通過使用高壓脈沖電場對樣品進行處理，來增加細胞質膜的通透性而造成細胞內的物質流出，可以用來提取黃酮[38]。將兩種提取工藝相結合會得到更好的提取效果。

金花葵渾身都是寶，金花葵類產品在市場上具有很大的發展前景，市場上對金花葵相關產品的需求也很大。同時，對金花葵中黃酮提取和純化的進一步研究也刻不容緩，優化金花葵中黃酮的提取工藝、增強金花葵中黃酮的提取效果，可以最大程度利用金花葵資源，這不僅對提取純化黃酮的研究具有極大的意義，而且能更好的為地方經濟服務。