基于HPLC指紋圖譜與近紅外光譜模型評價祖師麻膏藥質量*

董欣昱，張生杰，龐文娟，王 麗，田志梅，曹雪芹，劉小華

（武威市藥品檢驗檢測中心，甘肅 武威 733000）

祖師麻膏藥傳承了具有兩千多年歷史的黑膏藥工藝，以中藥祖師麻為主要原料，由“煉油下丹”“去火毒”“烊化攤涂”等傳統工藝制備而成[1]。祖師麻膏藥對風濕性關節炎、類風濕關節炎及中醫痹病寒濕阻絡證、瘀血阻絡證療效較好，尤其對濕寒阻絡、瘀血阻絡引起的肢體關節冷痛、沉重痛、關節發涼、腫脹、肌肉關節劇痛療效顯著[2]?，F代臨床研究發現，祖師麻膏藥短期應用與吲哚美辛巴布膏止痛效果相當，貼敷24 h可明顯緩解患者步行、上樓、繁重家務勞動時的關節、肌肉疼痛，其作用優于吲哚美辛巴布膏，但部分患者使用祖師麻膏藥后會有輕微的局部皮膚刺激癥狀[3-4]。研究發現，祖師麻酯類提取物和醇提取物都有顯著的鎮痛、抗炎作用[5]。網絡藥理學相關研究顯示，祖師麻治療類風濕關節炎具有多成分、多靶點、多途徑等作用的特點[6]。

高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜因靈敏度高、檢出限低、重復性好等優點，已被廣泛用于中藥質量的評價研究[7-8]。但是HPLC指紋圖譜容易受到實驗條件變化的影響，這給中藥質量評價帶來了一定的干擾[9]。近紅外光譜技術（NIRS）是一種環保、高效、便捷、無損、準確的綠色定性、定量分析技術，因其獨特的優勢被廣泛應用于中藥、化學藥物、生物制劑等藥物的定性定量分析、制劑生產過程控制及藥品監管等多個領域[10-12]。張振宇等[13]建立的近紅外光譜定量模型，實現了干姜多個活性成分含量的快速預測。利用近紅外光譜技術可以進行中藥真偽鑒別，貴重藥材和不同產地藥材的快速無損檢測，以及藥品生產過程中的質量控制[14-18]。這兩種不同化學信息的綜合質量評價方法在中藥質量評價中都被廣泛應用，但能否相互替代或者相互補充尚未有相關報道。本研究為了對祖師麻膏藥生產全過程進行質量控制，分別采用HPLC指紋圖譜和近紅外光譜模型進行祖師麻膏藥質量評價。

1 材 料

1.1 主要儀器 Agilent1260Ⅱ型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Bruker Matrix-F型近紅外光譜儀（德國布魯克公司）；MS205D型十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥物與試劑 祖師麻甲素（批號：110900-201607，含量：98.8%）購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜級，批號：JA086330）購于德國Merck 公司；磷酸（色譜純，批號：J2111704）購于阿拉??；祖師麻膏藥（規格：每張凈重10 g；批號：20220509，20220415，20220614，20220505，20220401，20220606，20220510，20220611，20220607，20220603，20220504）均購于甘肅泰康制藥有限責任公司；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取祖師麻甲素對照品12.10 mg，置100 mL容量瓶中，用85%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.3 供試品溶液的制備 將樣品置-20 ℃冰箱放置過夜，取出后迅速除去背襯，立即粉碎成粗粉，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水50 mL，密塞，稱定質量，先用力振搖10 min，再超聲處理（功率：150 W，頻率：50 kHz）1 h，放冷，稱定質量，用水補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性試驗 取樣品溶劑空白、祖師麻甲素對照品溶液、供試品溶液各20 μL，按照“2.1”項下色譜條件進行測定，結果在供試品色譜中各待測成分色譜峰分離度均大于1.5，其他雜質峰對祖師麻甲素無干擾。（見圖1）

圖1 HPLC 圖

2.4.2 線性關系考察 精密量取“2.2”項下祖師麻甲素對照品溶液，依次用甲醇溶液稀釋并制備成質量濃度為30.25、24.20、18.15、12.10、6.05 μg/mL系列對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸分析，得回歸方程Y=4 260.3X-4.5（r=0.999 8），表明祖師麻甲素在6.05～30.25 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.4.3 精密度試驗 稱取祖師麻膏藥（批號：20220509）約5.0 g，按照“2.3”項下供試品溶液制備方法制備，以“2.1”項下色譜條件連續進樣5次，記錄樣品溶液峰面積。結果表明祖師麻甲素峰面積的RSD值為0.90%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗 取“2.3”項下供試品溶液，分別在2、4、8、10、12、24 h后，以“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果供試品溶液在24 h內祖師麻甲素峰面積的RSD值為1.17%，表明供試品溶液在制備后24 h內穩定性良好。

WAP終端設備的處理能力較低，且無線網絡數據傳輸帶較窄，所以WPKI與傳統PKI技術有很大的區別，WPKI系統對數據和加密的簡潔性要求較高。兩者在編碼方法、證書格式、加密算法和密鑰中均存在一定的差異性。

2.4.5 重復性試驗 稱取祖師麻膏藥（批號：20220509）6份，按照“2.3”項下供試品溶液制備方法制備，測定祖師麻甲素峰面積，采用外標法計算祖師麻甲素含量，平均含量為126 μg/g，RSD值為1.21%，表明方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取已知祖師麻甲素含量的祖師麻膏藥（批號：20220509）6份，每份約5.0 g，精密稱定，按照“2.3”項下供試品溶液制備方法制備，分別精密加入祖師麻甲素約為供試品溶液中待測成分含量77%、96%、134%的對照品各2份，進樣分析采集祖師麻甲素峰面積代入線性方程計算相應含量，并計算平均加樣回收率和RSD值。結果表明祖師麻甲素平均加樣回收率為99.30%，RSD值為1.79%，表明方法準確度良好。（見表1）

表1 祖師麻甲素加樣回收率試驗結果 （n=9）

2.5 祖師麻甲素含量測定 取25批祖師麻膏藥樣品，每批樣品按“2.3”項下方法平行制備2份供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件進樣分析，每份樣品測定2次祖師麻甲素峰面積，用平均峰面積按外標法計算含量，結果見表2。

表2 樣品測定平均結果 （n=2）

2.6 HPLC指紋圖譜建立

2.6.1 指紋圖譜的建立 取25批祖師麻膏藥，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，采集25批祖師麻膏藥色譜圖，將HPLC法采集到的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.1版本）》軟件，以S1為參照指紋圖譜，采用多點校正后進行全譜峰自動匹配，并疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜。（見圖2）從25批祖師麻膏藥的指紋圖譜中，標記出10個共有峰。（見圖3）通過與祖師麻甲素對照品出峰時間和光譜圖參比確認祖師麻甲素峰（峰8）。計算共有峰與對照指紋圖譜的相對保留時間和相對峰面積，結果發現10個共有峰的保留時間RSD值小于0.5%，表明方法的重復性較好、方法穩定，可用于祖師麻膏藥質量考察；峰面積RSD值為25.5%～37.7%，其中標志性成分祖師麻甲素峰面積RSD值為28.5%，說明通過HPLC分析不同批次祖師麻膏藥化學成分含量存在顯著差異。

圖2 25 批祖師麻膏藥色譜峰匹配圖

圖3 祖師麻膏藥共有模式圖譜

2.6.2 相似度評價 將25批祖師麻膏藥色譜圖.cdf數據文件，導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.1版本）》軟件，計算各樣品間圖譜的相似度，結果25批樣品間的平均相似度為98.52%，RSD值為1.50%。（見圖3）指紋圖譜相似度分析結果顯示，祖師麻膏藥指紋圖譜一致性較好。（見表3）

表3 不同批次祖師麻膏藥HPLC 指紋圖譜相似度與NIR 平均光譜相似度

2.7 紅外光譜相關系數模型建立

2.7.1 樣品近紅外光譜采集 分別取25批祖師麻膏藥，在Matrix-F型傅里葉變換近紅外光譜儀掃描近紅外光譜，環境溫度18～30 ℃，空氣濕度＜70%，波數范圍為4 000～12 000 cm-1，分辨率為8 cm-1，每個樣品平行測定3次，掃描次數為75次，樣品不用去除外包裝，直接接觸測定，軟件為OPUS 5.5。（見圖4）

圖4 樣品近紅外光譜圖

2.7.2 相關系數模型的建立 將采集到的25批祖師麻膏藥的75張近紅外光譜圖全部導入OPUS 5. 5分析軟件求得平均光譜。（見圖5）以平均譜圖作為參考光譜建立相關系數模型。建模參數條件為：預處理方法為二階導數化+矢量歸一化，平滑點數17個，譜段為6 200～5 500 cm-1、5 000～4 700 cm-1，閾值為99%。各批次樣品與NIR平均光譜相似度結果顯示25批祖師麻膏藥在閾值99%時全部通過驗證，平均相似度99.90%，RSD值為0.02%，表明25批祖師麻膏藥相似度較高，質量穩定。（見表3）

圖5 平均光譜圖

2.8 紅外光譜一致性評價模型建立

2.8.1 一致性評價模型建立 用其中20批祖師麻膏藥的60張近紅外光譜圖來建立一致性評價模型，將60張近紅外光譜圖導入OPUS 5. 5分析軟件，建立一致性評價模型。建模參數條件為：光譜圖預處理方法為二階導數化+矢量歸一化，平滑點數13個，譜段為9 000～7 500 cm-1、6 900～5 600 cm-1、5 000～4 250 cm-1，一致性指數限度CI設置為7。

2.8.2 一致性評價模型驗證 另取5批祖師麻膏藥樣品的15張近紅外光譜圖作為檢驗光譜，將15張近紅外光譜圖導入模型以驗證所建一致性評價模型的可靠性，檢驗光譜應全部落入CI限度之內，方可認為模型通過驗證。驗證結果顯示，藍色點標注的檢驗光譜，全部落入紅色限度線之內。（見圖6）表明所建模型通過驗證，模型能夠對祖師麻膏藥進行一致性評價。驗證結果顯示，絕大多數點落在CI限度2～4之間，說明祖師麻膏藥質量較穩定。

圖6 一致性評價模型驗證圖

3 討 論

3.1 祖師麻膏藥樣品的預處理 祖師麻膏藥質量標準要求，在測定祖師麻甲素時，需將樣品在0 ℃下預處理后進行粉碎。實際試驗過程發現，0 ℃預處理不能使祖師麻膏藥基質完全固化。粉碎時產生的熱量使膏藥基質融化，不便于樣品取樣和稱量，同時膏狀黏稠基質很難在提取溶劑中溶散，以致影響含量測定的準確性。本試驗將樣品在-20 ℃條件下過夜處理后，用粉碎機粉碎成粗粉，迅速取樣并在提取溶劑中溶散，以確保取樣的代表性。

3.2 祖師麻甲素含量的穩定性 本研究通過HPLC法測定25批祖師麻膏藥中祖師麻甲素的含量，結果顯示不同批次祖師麻甲素含量差異很大，RSD值為28.5%，但標準只規定了祖師麻甲素含量下限，不得少于60 μg/g。測定結果顯示，祖師麻膏藥含量均合格。指紋圖譜相似度分析顯示，共有峰的保留時間RSD值小于0.5%，說明方法的重復性較好，但峰面積RSD值為25.5%～37.7%，說明不同批次祖師麻膏藥化學成分含量存在顯著差異。為研究其原因，本研究采用近紅外光譜相關系數模型和一致性評價模型研究不同批次祖師麻膏藥質量的穩定性。

3.3 建立近紅外光譜模型評價祖師麻膏藥質量 近紅外光譜相關系數模型是一種簡單易行的質量控制方法，即將某張光譜與一張參考光譜進行比較，計算兩張光譜在所選譜段內各波長點吸光度之間的相關系數（r）來反映兩張光譜的相似程度[19]。本試驗采用25批次樣品的平均光譜作為參照光譜建立相關系數模型。相關系數模型分析顯示，25批祖師麻膏藥的平均相似度99.90%，RSD值為0.02%，表明不同批次間祖師麻膏藥相似度較高，質量穩定。一致性評價模型檢驗是一種快捷的圖譜比較方法，用于比較未知光譜與某一組參考光譜是否具有一致性，同時能研究不同批次間藥品質量穩定性[20-21]。一致性評價模型分析顯示，在一致性指數限度7以內，25批次祖師麻膏藥全部通過驗證，表明25批次祖師麻膏藥質量穩定。

3.4 祖師麻膏藥中祖師麻甲素含量差異的原因 近紅外模型分析結果和指紋圖譜相關系數研究表明，25批祖師麻膏藥質量較穩定，造成HPLC法含量測定共有峰峰面積偏差大的原因主要是在制備供試品溶液的過程中，膏藥基質黏稠不易溶散，同時在用力振搖的過程中，力度和速率的不同影響溶散效果，以致提取溶劑不能將祖師麻甲素提取充分，造成不同樣品間含量測定結果偏差較大。為解決此問題，應事先將祖師麻膏藥進行低溫預處理，溫度越低越容易粉碎，同時在溶散過程中盡量避免人員誤差，采用搖床震蕩或采用冷凍粉碎技術避免對膏藥基質的影響。

3.5 近紅外光譜技術在藥品質量評價中的優勢 近紅外光譜可在無損傷樣品的情況下，快速對樣品進行化學信息的表征分析，而且不需要對樣品進行化學處理。該技術無污染、方便快捷，往往只需要幾十秒的時間就可以獲得樣品近紅外吸收光譜，同時在計算機分析軟件的支持下，可實現建立近紅外光譜模型、快速分析樣品光譜的功能。本研究建立了祖師麻膏藥的相關系數模型和一致性評價模型，均可用于評價祖師麻膏藥質量的穩定性，可以避免液相色譜技術在樣品處理過程中造成的偏差，同時近紅外光譜技術還可以應用于祖師麻膏藥生產全過程的質量控制。