超聲輔助酶提取、雙水相萃取及大孔樹脂純化天麻素的工藝研究*

田夢凡，高青青，易雅麗，國大亮，劉玉璇

（天津中醫藥大學，天津 301617）

中藥材天麻由常年異養型蘭科植物天麻（Gastrodia elata Bl.）的干燥塊莖制作而來，味甘，性平，歸肝經[1]。目前已知化學成分中占比最多的是酚類化合物[2]，主要為天麻素，即4-羥甲基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。天麻素屬天麻中小分子酚型糖苷[3]，具有鎮靜、催眠、抗驚厥、保護神經元、改善學習記憶能力、抗精神病等作用[4]。

目前天麻素提取純化技術有限且瑕瑜互見，因此，我們致力于尋找高效、環保且易操作的新興提取、純化方法。超聲輔助酶提取兼顧了超聲的機械性能和酶的水解作用，在破碎細胞壁、增加目標產物溶出、提高天麻素提取率、避免天麻素分解方面具有優勢[5]。本試驗還對提取液進行分離純化。近年來，雙水相萃取作為一種高效的分離技術被越來越多科研工作者關注[6]。雙水相體系是兩種不相容聚合物（例如聚合物與鹽或聚合物與聚合物）在水性溶劑中超過一定濃度，導致液相分離所形成[7]。雙水相體系多用于分離蛋白質、抗體及植物活性成分等[8]，可滿足當前生產快速、經濟和易于實施的要求[9]。

天麻素初步純化后需要再次精細純化，現有天麻素純化方法主要有高速逆流色譜法[10]、制備型高效液相色譜法[11]和大孔樹脂法[12]等。前兩者純化天麻素生產污染嚴重，且實驗設備要求較高，不適用于工業大生產。大孔吸附樹脂法吸附量大、熱穩定性好且綠色環保[13]。因此本試驗采用超聲輔助酶提取天麻素，通過雙水相萃取進行初步純化，再通過大孔樹脂進行精細純化，以提高目標產物純度，為制劑研發提供保障要求。

1 材 料

1.1 試藥與試劑 天麻由河北全泰藥業提供，經天津中醫藥大學中藥學院中藥資源教研室主任張堅副教授鑒定為天麻正品。天麻素對照品（批號：AF20100454，純度：98%）購于成都埃法生物科技有限公司；纖維素酶（批號：C805042）、α-淀粉酶（批號：C12227987）均購于上海麥克林生化科技有限公司；檸檬酸（批號：20200529）購于天津渤化化學試劑有限公司；硫酸銨（批號：20230103）購于福晨化學試劑有限公司；D301型弱堿性苯乙烯系陰離子樹脂（批號：20210720）、ADS-17大孔吸附樹脂（批號：20210720）、HPD100大孔吸附樹脂（批號：20231013）、AB-8型大孔吸附樹脂（批號：20210715）均購于北京索萊寶科技有限公司；乙腈為色譜純；無水乙醇為分析純。

1.2 主要儀器 HH-2型數顯恒溫水浴鍋（常州朗越儀器制造有限公司）；JP-060S型超聲波清洗器（深圳潔盟有限公司）；PHS-25型數顯酸度計（雷磁分析儀器廠）；RE-52AA型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；LC2000型高效液相色譜儀（上海天普分析儀器有限公司）；HY-2型調速多用振蕩器（江蘇榮華儀器制造有限公司）；L-530型離心機（湘儀離心機儀器有限公司）。

2 方 法

2.1 天麻素含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為GS-120-5 C18EX（4.6mm×250mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液（3∶97）；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測波長為220 nm；進樣量為20 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取5.05 mg天麻素對照品，置于25 mL容量瓶中，加乙腈-水（3∶97）溶液定容至刻度，即得質量濃度為0.202 mg/mL的天麻素對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取干燥天麻塊莖粉碎，過30目篩，稱取天麻粗粉2.0 g于具塞錐形瓶，按0.5%酶比例加入α-淀粉酶，按1∶30料液比加入pH值=7的溶劑，在60 ℃水浴鍋中提取60 min，后經超聲處理（功率：180 W，頻率：40 kHz）30 min，于100 ℃中將酶滅活10 min，濾去藥渣，減壓旋轉蒸發至生藥質量濃度為0.1 g/mL。

2.2 天麻素標準曲線繪制 分別精密吸取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，于10 mL容量瓶，加乙腈-水（3∶97）溶液定容，得到質量濃度分別為0.020 2、0.040 4、0.060 6、0.080 8、0.101 0、0.121 2、0.141 4 mg/mL的天麻素溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積，繪制天麻素標準曲線。

2.3 提取工藝優化

2.3.1 單因素試驗考察 基于“2.1.3”項下供試品溶液制備方法及其他條件固定，對酶種類（纖維素酶、α-淀粉酶）及比例（0∶0、3∶0、2∶1、1∶1、1∶2、0∶3）、料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60）、加酶量（0.2%、0.5%、0.8%、1.0%、1.5%）、酶解時間（20、40、60、80、100 min）、酶解溫度（30、40、50、60、70 ℃）、酶解pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）進行單因素試驗考察，每組試驗重復3次，以天麻素提取量為指標，考察不同因素對天麻中天麻素提取量的影響。

2.3.2 正交試驗設計優選天麻素提取工藝 根據單因素考察結果，選取對天麻素提取量影響較大的4個因素[料液比（A）、加酶量（B）、酶解時間（C）、酶解溫度（D）]用正交試驗表設計試驗。

表1 試驗設計參數

2.3.3 最佳工藝驗證 參照最優正交試驗工藝參數提取3批天麻素，計算天麻素含量，驗證工藝穩定性。

2.4 純化工藝優化

2.4.1 雙水相萃取初步純化天麻素

2.4.1.1 雙水相系圖繪制 參照ALBERTSSON P A[14]的濁點滴定方法繪制雙水相體系圖，操作如下：稱取一定量硫酸銨溶于去離子水，待完全溶解后滴加無水乙醇并震蕩，加至溶液出現渾濁為止，記錄消耗無水乙醇的體積。再向體系中滴加去離子水并震蕩，加至溶液重新變為澄清，記錄所加去離子水體積。反復進行上述操作，記錄每次加入乙醇和去離子水體積，計算硫酸銨質量分數和乙醇體積分數，繪制雙水相系圖。

2.4.1.2 雙水相萃取工藝 取一定量天麻提取液，加入一定量的硫酸銨，溶解后置4 ℃冰箱冷藏12 h，進行低溫鹽析反應，經3 000 r/min（離心半徑為93 mm）離心5 min，棄去鹽析出的不溶物，將上清液按一定乙醇體積分數加入乙醇，振搖5 min，靜置，待分層清晰穩定后，吸取上層液測定天麻素含量。

2.4.1.3 雙水相萃取工藝參數考察 基于“2.4.1.2”項下方法及其他條件固定，根據雙水相系圖和預試驗結果，對硫酸銨質量分數（12.5%、15.0%、17.5%、20.0%、22.5%）、提取液濃度（0.10、0.15、0.20、0.30、0.40 g/mL），乙醇體積分數（40.0%、42.5%、45.0%、47.5%、50.0%）進行考察，計算天麻素萃取量。

2.4.1.4 雙水相萃取工藝驗證 將所得雙水相萃取最佳工藝參數進行天麻素萃取，驗證3批。

2.4.2 大孔樹脂純化天麻素

2.4.2.1 大孔樹脂純化工藝 （1）大孔樹脂預處理：95%乙醇浸沒大孔樹脂（HPD100、AB-8、ADS-17、D301）24 h，并沖洗至白色渾濁徹底除去，后用蒸餾水沖洗至無醇味，依次用5%HCl和5%NaOH分別浸泡大孔樹脂4 h后用蒸餾水沖洗至中性，裝柱備用。

（2）靜態吸附及解吸試驗：稱取各型號大孔樹脂1.0 g于具塞錐形瓶中，分別加入20 mL萃取液，于25 ℃條件下以100 r/min（震蕩幅度為20 mm）在恒溫震蕩儀上震蕩24 h，測定上清液中天麻素含量，計算靜態吸附率和靜態吸附量。將吸附飽和的樹脂用蒸餾水沖洗后用70%乙醇解吸，相同條件下震蕩24 h。檢測解吸出液體中天麻素含量，計算靜態解吸率和靜態解吸量。

（C0：吸附前天麻素濃度；C1：吸附后上清液天麻素濃度；V1：吸附后上清液體積；M：大孔樹脂質量；C2：解吸液天麻素濃度；V2：解吸液體積。）

（3）動態吸附及解吸實驗：取一定量篩選好的大孔樹脂，預處理后，濕法裝入潔凈玻璃色譜柱，取一定濃度萃取液以一定流速上樣，直至大孔樹脂吸附飽和，收集未被吸附的流出液，計算吸附量和吸附率。后用大量蒸餾水沖洗至無萃取液殘留。用一定質量分數乙醇以一定流速洗脫至完全，收集洗脫液，計算解吸量和解吸率。

2.4.2.2 大孔樹脂純化工藝參數考察 利用靜態吸附及解吸試驗對大孔樹脂型號進行篩選，對上樣液濃度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/mL）和洗脫液體積分數（10%、30%、50%、70%、90%）進行考察；利用動態吸附及解吸實驗對上樣流速（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 BV/h）和徑高比（1∶3、1∶5、1∶7）進行考察；后根據考察結果進行上樣量考察，并對洗脫流速（2、3、4、5、6 BV/h）進行考察，最后對洗脫劑用量進行考察。

2.4.2.3 大孔樹脂純化工藝驗證 將所得大孔樹脂最佳工藝參數進行天麻素純化驗證，共驗證3批。

3 結 果

3.1 天麻素標準曲線 對天麻素對照品質量濃度和峰面積進行線性關系考察，得到回歸方程：y=847 536x+2 240.7，r=0.999 7，說明天麻素在0.020 2～0.141 4 mg/mL質量濃度范圍內線性關系良好。（見圖1）

圖1 天麻素標準曲線圖

3.2 提取工藝優化

3.2.1 單因素試驗考察結果 由圖2a可知，加纖維素酶和α-淀粉酶明顯有助于提高天麻素提取量，且天麻素提取量隨著α-淀粉酶所占比例增加而逐漸提高，當酶全部為α-淀粉酶時，天麻素提取量達到最高，且纖維素酶和α-淀粉酶沒有協同作用，因此，選擇單獨用α-淀粉酶進行酶解反應。

圖2 超聲輔助酶提取單因素試驗考察結果圖

由圖2b可知，天麻素提取量隨著加酶量的增加呈現先上升后下降趨勢。在加酶量到達0.5%時，天麻素提取率達到最高，后下降原因猜測是加酶量過多，吸附包裹在藥材表面，從而影響有效成分溶出。因此，選擇加酶量0.5%進行后續試驗。

由圖2c可知，天麻素提取量隨料液比增大而呈現先增大后減小趨勢。在料液比為1∶30時，天麻素提取量最大，推測可能原因是隨料液比增加，使液體體積在增加，體系的黏度降低，天麻素較容易提取出來。當料液比超過1∶30，酶的有效作用濃度和底物濃度被稀釋，酶的結合能力也隨之降低，從而使天麻素溶出降低。因此，選擇料液比為1∶30進行后續試驗。

由圖2d可知，天麻素提取量隨著酶解時間的增加呈現先上升后下降趨勢。在酶解時間達到60 min時，天麻素提取量達到最高。酶解時間過長導致有效成分性質改變，從而降低了天麻素提取量。因此，選擇酶解時間60 min進行后續試驗。

由圖2e可知，天麻素提取量隨著酶解溫度的升高呈現先上升后下降趨勢。在酶解溫度達到50℃時，天麻素提取量達到最高，后下降原因是溫度較高，酶活性降低，從而影響有效成分提取。因此，選擇酶解溫度50 ℃進行后續試驗。

由圖2f可知，天麻素提取量隨著酶解pH值的增加呈現先上升后下降趨勢。在酶解pH值達到5.5時，天麻素提取量達到最高；α-淀粉酶活性受pH值影響。pH值=5.5時，α-淀粉酶發揮最大活性，后隨pH值增大而活性降低。因此選擇pH值=5.5進行后續試驗。

3.2.2 正交優化試驗設計 正交優化試驗結果見表2，4個因素對天麻素提取量影響順序為：A>C>B>D。因此天麻素提取量的正交優化試驗最優組合為A2B3C3D3，即料液比（g/mL）為1∶30，加酶量（g/g）為0.8%，酶解時間為80 min，酶解溫度為60 ℃。方差分析見表3，因素A、B、C、D對天麻素提取量的影響均達到顯著水平（P＜0.05）。

表2 正交設計實驗結果

表3 方差分析結果

3.2.3 最佳提取工藝驗證 按照天麻素提取量的正交優化試驗最優組合A2B3C3D3，即料液比（g/mL）為1∶30，加酶量（g/g）為0.8%，酶解時間為80 min，酶解溫度為60 ℃，進行3次平行驗證試驗，測得天麻素提取量結果依次為5.826、5.686、5.629 mg/g，平均值為5.714 mg/g，RSD值為1.77%，表明最優條件下提取天麻中天麻素工藝較為穩定可靠，可用于后續試驗。

3.3 純化工藝考察結果

3.3.1 雙水相萃取

3.3.1.1 雙水相系圖繪制 乙醇-硫酸銨雙水相系圖見圖3。圖中曲線為雙水相臨界點，曲線下方是均一相區，上方是雙水相區，在雙水相體系中有機溶劑的質量分數與無機鹽的質量分數呈負相關。雙水相體系選擇應遵從既能成相又不飽和析出原則，選擇曲線上方合適乙醇體積分數和硫酸銨質量分數。

3.3.1.2 雙水相萃取工藝參數考察 由圖4a可知，當乙醇體積分數小于40%時，體系不能形成兩相；乙醇體積分數大于50%時，會有鹽析出。隨著乙醇體積分數增加，兩相的體積比亦隨之增大，原因是乙醇奪取鹽相中水分子，上相體積隨乙醇體積分數增大而增加，且上相中乙醇的濃度是增加的。這有利于天麻素更多分配到上相中，因此天麻素萃取量增大。最終選擇乙醇體積分數為47.5%。

圖4 雙水相萃取工藝考察結果

由圖4b可知，隨著硫酸銨質量分數的增加，萃取量先增加，到硫酸銨質量分數為17.5%時達到最大，而后呈現變化幅度較小的下降趨勢。其原理是隨著硫酸銨質量分數的增加，萃取逐漸達到完全，而超過17.5%后，繼續增加鹽濃度會爭奪水導致萃取量下降。在硫酸銨質量分數為17.5%時，分配系數和萃取率均達到各自的最大值?？紤]到節省成本，選擇硫酸銨質量分數為15.0%。

由圖4c可知，當提取液濃度高于0.2 g/mL時，隨提取液質量濃度增加，天麻素萃取量降低，原因是濃度過高，乙醇和鹽加入量變低，導致提取不完全，提取液質量濃度低于0.2 g/mL，趨于平穩。所以選擇0.2 g/mL提取液濃度。

3.3.2 大孔樹脂純化工藝

3.3.2.1 大孔樹脂型號篩選 由圖5a可知，吸附率：HPD100＞D301＞ADS17＞AB-8；解吸率：AB-8＞HPD100＞ADS-17＞D301，綜合考量4種大孔樹脂吸附率和解吸率，選擇HPD100進行后續處理。

圖5 大孔樹脂純化工藝考察結果

3.3.2.2 上樣濃度篩選 由圖5b可知，天麻素上樣濃度為0.1～0.2 g/mL時，吸附率變化不大且均大于50%；天麻素上樣濃度高于0.2 g/mL時，吸附率隨上樣濃度升高逐漸降低。原因是低濃度天麻素萃取液經過大孔樹脂時，樹脂吸附量有限，當濃度大于0.2 g/mL時，大孔樹脂較難吸附完全?？紤]到吸附效率等因素，選擇天麻素上樣濃度為0.2 g/mL進行后續試驗。

3.3.2.3 徑高比 由圖5c可知，徑高比為1∶5時吸附量和吸附率均達到最大，猜測原因是徑高比較小時，對天麻素上樣液吸附不完全而導致浪費較多；徑高比越大，樹脂吸附越不飽和，樹脂利用越不充分。因此選擇徑高比為1∶5進行后續試驗。

3.3.2.4 上樣流速考察 由圖5d可知，隨著天麻素上樣液流速的增大，大孔樹脂對天麻素的吸附率均呈現下降趨勢。當天麻素上樣液流速在2～3 BV/h時，吸附率趨向平穩。當天麻素上樣液流速大于3 BV/h時，大孔樹脂對天麻素的吸附率呈顯著降低趨勢?？紤]到吸附效率等因素，選擇3 BV/h進行后續試驗。

3.3.2.5 上樣量考察 由圖5e可知，上樣量達到60 mL時，天麻素已經發生泄露；上樣量達到100 mL時，天麻素的質量濃度為0.07 mg/mL，達到上樣液濃度的1/10；上樣量超過180 mL后上樣量與泄漏量達到動態平衡，此時大孔樹脂吸附飽和。因此選擇上樣量為100 mL。

3.3.2.6 洗脫液體積分數考察 由圖5f可知，隨乙醇體積分數增大，解吸率先增加后減小。當乙醇體積分數為30%時，解吸率達到最高，為98.4%。因此選擇洗脫液乙醇體積分數為30%進行后續試驗。

3.3.2.7 洗脫流速考察 由圖5 g可知，解吸率隨洗脫流速增加呈現先增大后減小趨勢，在洗脫流速為4 BV/h時解吸率最大。洗脫流速過快導致30%的乙醇大孔樹脂上停留時間短，無法將天麻素解吸完全，因此選擇洗脫流速為4 BV/h進行后續試驗。

3.3.2.8 洗脫劑用量考察 由圖5h可知，隨著洗脫液用量增多，洗脫的天麻素質量濃度不斷增大。當30%乙醇用量為90 mL時，洗脫出天麻素質量濃度達到最高，繼續洗脫，洗脫出天麻素質量濃度持續下降。當洗脫液體積增加到230 mL時，洗脫出天麻素質量濃度約為洗脫液用量為90 mL時的1/25，表明被大孔樹脂吸附的天麻素基本被洗脫完全，因此選擇洗脫劑用量為230 mL。

3.3.3 試驗驗證 經試驗選擇雙水相初步純化天麻素最佳工藝為乙醇體積分數為47.5%，硫酸銨質量分數為15.0%，提取液濃度為0.2 g/mL。選擇大孔樹脂進一步純化天麻素最佳工藝為選擇HPD100大孔樹脂，上樣濃度為0.2 g/mL，徑高比為1∶5，上樣流速為3 BV/h，上樣量為100 mL，洗脫液體積分數為30.0%，洗脫流速為4 BV/h，洗脫劑用量為230 mL。3批試驗驗證結果見表4。純化后的天麻素純度比純化前提高了5.43倍，純化效果顯著。

表4 純化工藝驗證結果

4 討 論

天麻始載于《神農本草經》[15]，被列為“上品”，性溫和，有息風通絡、平肝止痙之功效。天麻常配伍川芎、半夏、鉤藤等藥物治療頭痛類病證[16]。近年來，對天麻藥用研究愈來愈多。本研究著眼于天麻中含量較多，功效研究較全面的酚類化合物天麻素，考慮建立高效的提取純化方法，為后續制劑及病證治療奠定基礎。目前天麻素提取方法主要有傳統浸泡提法、熱回流提取法等。這些方法耗時長且效率低，存在溶劑安全問題[17]。相較而言，超聲輔助酶提取方法提取效率高、綠色環保[18]。其原理是利用酶的水解性使植物細胞壁及細胞間質組分中的有效成分溶出，并且利用超聲波產生空化效應和強烈的振動使藥材細胞壁破碎，從而促進藥材中的有效成分轉移至提取溶劑中[19]。本研究通過單因素試驗和正交試驗發現最佳提取工藝為：料液比（g/mL）為1∶30，加酶量（g/g）為0.8%，酶解時間為80 min，酶解溫度為60 ℃，酶解pH值為5.5。3批驗證試驗結果也證明該工藝穩定。

本研究采用雙水相體系進行初步分離，原理是利用天麻素在上、下相優先分布的分配系數會因電荷作用、化學鍵產生的影響發生相應的變化，達到分離目的[20]。此方法耗能低、耗材少，具有靈活性和可靠性?？疾熳罴压に嚍橐掖俭w積分數為47.5%，硫酸銨質量分數為15.0%，天麻素提取液濃度為0.2 g/mL。吸附性大孔樹脂是一種高度交聯的非離子樹脂，吸附/解吸機制受氫鍵和范德華力的調節[21]，同時大孔吸附樹脂的多孔結構使其具有分子篩作用[22]。本研究通過試驗明晰最佳上樣和洗脫條件，以達到最好的分離純化效果。此前有研究純化天麻素純度可達到20.14 mg/g[12]，本研究分離純化效果更優。最佳工藝為選擇HPD100大孔樹脂，上樣濃度為0.2 g/mL，徑高比為1∶5，上樣流速為3 BV/h，上樣量為100 mL，洗脫液體積分數為30%，洗脫流速為4 BV/h，洗脫劑用量為230 mL。3批試驗驗證結果顯示純化后的天麻素純度比純化前提高了5.43倍，純化效果顯著。

天麻素提取純化試驗發現：（1）通過預試驗驗證超聲輔助酶提取天麻素效果優于單純超聲提取和酶提??；（2）與傳統雙水相體系先配制分層后再加提取液不同，本研究采用先鹽析，待除去鹽析出的雜質后再加醇進行雙水相萃取，分離效果更佳；（3）天麻素高效、可工業化純化始終是個難點。采用其他方法，如硅膠色譜法、分子印跡法等進行純化，可能取得更理想化成果，從而為天麻素成分深入研究和應用提供技術支持。