膽汁酸通過調控HOXB7促進胃黏膜腸化生

林可昕，姚 諾，趙行雨，曲曉東，李學志，李嵩博，董 強，王 娜，時永全

(國家消化系統疾病臨床醫學研究中心，消化系腫瘤整合防治全國重點實驗室，空軍軍醫大學西京消化病醫院，陜西 西安 710032)

胃黏膜腸化生(gastric intestinal metaplasia，GIM)是一種常見的胃癌前病變。腸型胃癌的發生發展遵循Correa模型，即正常胃黏膜發生淺表性胃炎，持續炎癥刺激下發生慢性萎縮性胃炎、GIM、異型增生，最終進展為胃癌。臨床研究表明，膽汁反流是胃癌及癌前病變的獨立危險因素[1-2]。膽汁酸是膽汁的主要成分，其中最豐富的是脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)和鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)。有研究發現，DCA能夠誘導GIM，并促進胃癌的發生和進展[3]。DCA可顯著上調HNF4A在胃上皮細胞中的表達，而胃黏膜上皮細胞特異性的HNF4A轉基因小鼠在DCA誘導后可出現GIM表型[4]。DCA通過上調c-Myc表達，增強端粒酶活性并促進胃癌進展[5]。上述研究只能部分解釋DCA誘導GIM和促進胃癌進展的作用，仍需進一步研究進行其他的機制探索。

HOXB7屬于同源盒轉錄因子HOX家族。HOX家族分為A～D四個簇，在胚胎發育過程中參與調控消化道吻尾軸的形成。HOXB7表達改變被認為與癌癥惡性表型密切相關，能夠促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲，并抑制凋亡[6-10]。在Barrett食管及食管腺癌中，HOXB7表達增高，通過影響組蛋白修飾和染色質壓縮程度，在早期階段啟動腫瘤轉錄程序的改變[11]。近年來有研究證實，HOXB7在胃癌組織中的表達較癌旁組織增強，并與患者不良預后相關[8，12]。

CDX2是腸道分化的關鍵轉錄因子。在正常的消化道中，CDX2僅表達于下消化道。但在GIM組織中，CDX2的表達顯著升高。研究表明，CDX2的異常激活和過表達可以直接促進GIM的發生。HOXB7和CDX2均為消化道吻尾軸形成的關鍵分子，我們推測，HOXB7可能通過調控腸型標志分子CDX2等的表達，直接參與了GIM的形成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本 在空軍軍醫大學西京醫院內鏡中心收取14例GIM患者的GIM組織及配對正常胃黏膜組織。研究方案符合人體試驗倫理學標準，得到空軍軍醫大學西京醫院醫學倫理委員會的審核批準(許可證號：KY20202100-F-1)，并且受試者知情同意。

1.1.2 實驗動物 6周齡C57BL6小鼠購自空軍軍醫大學實驗動物中心，實驗經空軍軍醫大學實驗動物福利與倫理委員會批準(許可證號：20220481)。

1.1.3 細胞與試劑 永生化胃上皮細胞系、胃癌細胞系、腸上皮細胞系(賽柏康，中國)；胎牛血清(IC-1905，InCellGene，美國)；培養基及孵箱(Thermo，美國)；RNA提取試劑盒(AG21023，艾科瑞，中國)；反轉錄試劑(AG11706，艾科瑞，中國)；qRT-PCR試劑(CM0139，艾科瑞，中國)；Western blotting試劑及儀器(Bio-Rad，美國)；HOXB7過表達質粒(吉凱，中國)；HOXB7siRNA(吉瑪，上海)；Attractene Transfection Reagent(301005，Qiagen，德國)。Western blotting一抗：anti-CDX2(#12306，CST，美國)、anti-MUC2(#ab133555，Abcam，英國)、anti-KLF4(#4038，CST，美國)、anti-HOXB7(#12613-1-AP，Proteintech，美國)和anti-β-actin(#AP0060，Bioworld，美國)；Western blotting二抗(ZB2306，中杉金橋，中國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 永生化胃上皮細胞系GES-1，胃癌細胞系BGC-823、HGC-27、NCI-N87，正常腸上皮細胞系FHC、NCM-460，均使用含100 mL/L胎牛血清和10 mL/L青霉素-鏈霉素的RPMI1640或DMEM培養基培養，培養條件為37 ℃、50 mL/L CO2。

1.2.2 細胞轉染及細胞感染 待細胞融合度達50%時，按照Qiagen轉染試劑說明書配置轉染混合物，加入6孔板中。孵箱培養4～6 h后換為完全培養基。HOXB7過表達質粒：CMV enhancer-MCS-SV40-puromycin。HOXB7siRNA：正義鏈CCCAGAACAAACUUCUUGUTT，反義鏈ACAAGAAGUUUGUUCUGGGTT。轉染48 h后收取細胞RNA及蛋白，用于后續檢測。

1.2.3 RNA提取及qRT-PCR檢測 細胞RNA按照艾科瑞公司總RNA提取試劑盒(AG21023)說明書提取。組織RNA使用TRIzol法提取。使用Biodrop分光光度計測定RNA濃度，并按照艾科瑞反轉錄試劑盒(AG11706)說明書進行反轉錄。qRT-PCR體系按照艾科瑞SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒(AG11701)說明書配置。儀器使用CFX96TMReal-Time PCR Detection system(Bio-Rad Laboratories，美國)，結果通過2ΔΔCq法計算分析。

1.2.4 總蛋白提取及Western blotting 細胞使用RIPA裂解，并加入1∶100的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，超聲粉碎、離心，加入1/5的上樣緩沖液煮沸變性后進行檢測。Western blotting使用Bio-Rad儀器及相關試劑進行。

2 結果

2.1 膽汁酸誘導HOXB7在GIM細胞模型中表達上調

使用DCA對胃上皮細胞GES-1進行誘導以建立GIM細胞模型。Western blotting結果顯示，DCA以濃度依賴(圖1A)和時間依賴(圖1B)的方式誘導腸型標志分子CDX2和MUC2表達上調，提示GIM細胞模型構建成功。qRT-PCR檢測結果表明，DCA能以濃度依賴(P<0.01，圖1C)和時間依賴(P<0.01，圖1D)的方式顯著誘導HOXB7mRNA在GIM細胞模型中的表達。Western blotting顯示，HOXB7在GES-1細胞中呈微弱表達；受DCA誘導后，HOXB7的蛋白表達水平在2 h即出現明顯上調；DCA對HOXB7蛋白的表達誘導效應呈濃度依賴(圖1A)和時間依賴(圖1B)。

A：Western blotting檢測不同濃度DCA處理的GES-1細胞中HOXB7及腸型標志分子的蛋白表達水平；B：Western blotting檢測100 μmol/L DCA處理不同時間的GES-1細胞中HOXB7及腸型標志分子的蛋白表達水平；C：qRT-PCR檢測不同濃度DCA處理的GES-1細胞中HOXB7 mRNA水平；D：qRT-PCR檢測100 μmol/L DCA處理不同時間的GES-1細胞中HOXB7 mRNA水平。DCA：脫氧膽酸。bP<0.01。

2.2 HOXB7在胃癌及腸上皮細胞系中表達水平高于永生化胃上皮細胞GES-1

qRT-PCR結果顯示，HOXB7在胃癌細胞系BGC-823、HGC-27、NCI-N87及正常腸上皮細胞系FHC、NCM-460中表達水平遠高于永生化胃上皮細胞GES-1(P<0.01，圖2A)。Western blotting結果顯示，在蛋白水平上，HOXB7在多數胃癌細胞系及正常腸上皮細胞系中的表達高于GES-1細胞系，且在胃癌細胞系BGC-823、HGC-27中表達最高(圖2B)。

A：qRT-PCR檢測各細胞系中HOXB7的mRNA表達水平；B：Western blotting檢測各細胞系中HOXB7的蛋白表達水平。bP<0.01 vs GES-1。

2.3 HOXB7在腸黏膜和GIM組織中表達水平高于正常胃黏膜組織

為探究HOXB7是否具有腸道高表達特征，我們取正常C57BL6小鼠的食管、胃、腸黏膜組織，利用qRT-PCR檢測HOXB7的mRNA表達水平。結果表明，HOXB7在大腸黏膜組織中表達水平最高，胃黏膜組織次之，食管黏膜組織中表達水平最低(P<0.05，圖3A)，呈吻尾軸表達模式。

A：qRT-PCR檢測小鼠消化道黏膜組織中HOXB7的mRNA表達水平(P<0.05)；B：qRT-PCR檢測14例GIM組織及其配對正常胃黏膜組織中HOXB7的mRNA表達水平(bP<0.01)。GIM：胃黏膜腸化生。

為明確HOXB7在GIM組織中的表達情況，我們收集14例GIM患者的GIM組織及其配對正常胃黏膜組織，檢測其中HOXB7的mRNA表達水平。結果顯示，HOXB7在GIM組織中的表達水平顯著高于配對正常胃黏膜組織(P<0.01，圖3B)。由此提示，作為腸道發育因子的HOXB7可能參與了GIM發生的調控。

2.4 HOXB7促進腸型標志分子在胃上皮細胞中的表達

根據各細胞系HOXB7本底表達情況，我們選擇GES-1細胞系及胃癌BGC-823和HGC-27細胞系進行功能驗證實驗。在轉染HOXB7過表達質粒后，腸型標志分子CDX2及MUC2的mRNA和蛋白表達水平在GES-1細胞中顯著上調(P<0.05，P<0.01，圖4A)。利用特異性siRNA分別敲低HOXB7在BGC-823和HGC-27細胞中的表達，CDX2和MUC2的表達水平在BGC-823細胞中顯著下調(P<0.01，圖4B)，CDX2和KLF4的表達水平在HGC-27細胞中顯著下調(P<0.01，圖4C)。以上結果說明，HOXB7能夠促進多種腸型標志分子在胃上皮細胞中的表達。

A：在GES-1細胞中過表達HOXB7，qRT-PCR和Western blotting檢測HOXB7、CDX2和MUC2的mRNA和蛋白表達水平；B：在BGC-823細胞中敲低HOXB7，qRT-PCR和Western blotting檢測HOXB7、CDX2和MUC2的mRNA和蛋白表達水平；C：在HGC-27細胞中敲低HOXB7，qRT-PCR和Western blotting檢測HOXB7、CDX2和KLF4的mRNA和蛋白表達水平。aP<0.05，bP<0.01。

2.5 敲低HOXB7能夠減弱DCA對腸型標志分子的表達誘導作用

為探究HOXB7是否參與了膽汁酸對GIM的誘導，我們利用HOXB7特異性的siRNA敲低HOXB7在GES-1細胞中的表達，并用100 μmol/L DCA對細胞進行誘導處理24 h。qRT-PCR檢測結果表明，DCA能夠顯著升高HOXB7(P<0.01)、CDX2(P<0.01)和MUC2(P<0.05)在GES-1細胞中的mRNA表達水平，但聯合轉染HOXB7siRNA能大幅減弱DCA對上述分子的表達誘導作用(圖5A)。Western blotting檢測結果顯示，敲低HOXB7也在一定程度上減弱了DCA對CDX2和MUC2的蛋白表達誘導作用(圖5B)。

A：qRT-PCR檢測HOXB7及腸型標志分子的mRNA水平；B：Western blotting檢測HOXB7及腸型標志分子的蛋白水平。DCA：脫氧膽酸。aP<0.05，bP<0.01。

3 討論

胃癌是全球第五大癌癥。根據世界衛生組織2020年全球癌癥統計報告，胃癌發病率排名第五，死亡率排名第四[13]?，F廣泛應用的Lauren組織學分類根據腺體結構將胃腺癌分為彌漫型和腸型[14]，腸型腺癌是胃癌最常見的病理類型。GIM作為腸型腺癌癌前病變，是腸型胃癌發生過程中的重要環節。幽門螺桿菌感染是胃癌及癌前病變的主要致病因素。但WONG等[15]發現，在已經存在癌前病變的患者中，根除幽門螺桿菌治療并不能降低胃癌的發病率，提示應重視胃癌的其他致病因素。

膽汁反流是胃癌及癌前病變的獨立危險因素。膽汁酸已被證實與胃癌及癌前病變密切相關[16]。甘氨鵝脫氧膽酸和DCA通過c-Myc促進胃癌細胞增殖、抑制細胞凋亡，并激活端粒酶活性[5]。?；敲撗跄懰嵬ㄟ^激活IL-6/JAK1/STAT3通路促進GES-1細胞增殖，促進癌前病變及胃癌的發生[17]。膽酸能夠上調RGM-1細胞CDX2及CINC1表達，使細胞發生GIM轉變[3]。CDCA上調miR-92a-1-5p，通過靶向FOXD1進而上調CDX2促胃上皮細胞GIM[18]。然而上述研究只能在部分程度上解釋膽汁酸促進GIM的機制，仍需要進一步探索其他分子在其中的作用。

HOXB7是HOXB家族的成員。HOXB7能增強結直腸癌DNA修復，促進細胞存活[6]。HOXB7可通過激活MAPK通路促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲[8]，也可通過PIK3/AKT通路增強胃癌細胞的惡性生物學特性[12]。另外，近年來有研究表明，HOXB7能夠促進Barrett食管的發生，并可能通過組蛋白翻譯后修飾和染色質壓縮程度影響基因表達，成為食管腺癌發生的潛在啟動因素[11]。HOX家族成員和CDX2都是調控消化道吻尾軸形成的關鍵分子，它們在正常情況下高表達于下消化道，但不表達于上消化道。大量研究表明，CDX2在胃上皮細胞的異常激活和過表達是GIM形成的重要機制。那么，HOXB7是否也參與了GIM的發生調控呢？

在本研究中，我們首先利用GES-1細胞構建了GIM模型。我們發現在DCA的誘導下，HOXB7呈濃度依賴性及時間依賴性上調。同時在HOXB7上調的過程中，還伴隨著CDX2、KLF4和MUC2等腸型標志分子的上調。這提示在膽汁酸誘導的GIM模型中，HOXB7表達增高，并可能參與腸型標志分子的表達調控。之后我們檢測了胃癌細胞系及正常腸上皮細胞系HOXB7的表達情況。HOXB7在腸上皮細胞中的表達水平顯著高于胃上皮細胞。而胃癌細胞中HOXB7表達增高，提示HOXB7的增加可能賦予了胃上皮細胞腸型特征，驅動胃癌的發生。另外，在小鼠食管-胃-小腸-大腸黏膜組織中，HOXB7在食管和胃中表達低，在大腸中表達最高。這種差異可能意味著HOXB7與腸道表型密切相關，HOXB7有可能參與GIM甚至胃癌的發生。為了在臨床樣本中檢驗HOXB7與GIM的關系，我們檢測了HOXB7在14例GIM患者的GIM組織及配對正常胃黏膜組織中的表達，結果顯示HOXB7在腸化組織中表達水平遠高于正常組織。細胞生物學的研究表明，在GES-1細胞中過表達HOXB7能促進腸型標志分子CDX2和MUC2的表達，而在BGC-823或HGC-27細胞中敲減HOXB7則可降低CDX2、MUC2或KLF4的表達水平。挽救實驗證實，敲低HOXB7能減弱DCA對多種腸型標志分子的表達誘導作用。由此提示，HOXB7參與了DCA對腸型標志分子的誘導調控。

綜上所述，本文證實了HOXB7在DCA誘導的GIM中的關鍵作用。HOXB7在GIM細胞模型和GIM黏膜組織中表達增高，HOXB7能調控腸型標志分子CDX2、KLF4及MUC2的表達，敲低HOXB7能顯著減弱DCA對腸型標志分子的表達誘導作用。進一步探討HOXB7參與GIM發生的機制，可為逆轉GIM進而預防胃癌提供新思路。