微管蛋白α-1B在泛癌中的表達及臨床意義

劉 藝，周曄祿，賀文芳，盧瑗瑗，趙曉迪，吳開春

(國家消化系統疾病臨床醫學研究中心，消化系腫瘤整合防治全國重點實驗室，空軍軍醫大學西京消化病醫院，陜西 西安 710032)

癌癥是世界范圍內重要的公共衛生問題，每年全世界約有1 900萬新發病例和1 000萬死亡病例，給個人、家庭、社區和衛生系統帶來了巨大的負擔[1]。單一癌癥種類的研究限制了我們對基因多面性和潛在機制的全局視野，描述基因在不同腫瘤類型的差異和相似性對識別腫瘤發生的基本動態以及為診斷、預后和治療提供信息至關重要。泛癌分析是一種跨多種癌癥類型的分子畸變分析，可將來自不同譜系癌細胞的特征進行整理總結，以發現失調的關鍵生物學過程[2]，泛癌基因探索已成為揭示癌癥基因機制的一種重要手段。

微管蛋白α-1B(tubulin alpha-1B，TUBA1B)基因編碼微管蛋白α-1B鏈，可水解GTP使微管生長[3]。TUBA1B的c端尾部有7個谷氨酸殘基，能夠發生谷氨?；?、甘氨酸化和去酪氨酸化[4-5]。通過此c端，TUBA1B可與微管結合蛋白相互作用，包括細胞骨架相互作用因子和細胞骨架調節因子。目前已有多項研究表明TUBA1B在多種腫瘤中表達升高，通過影響細胞極性、遷移、骨架形成等參與疾病發展，如鼻咽癌[6]、乳腺癌[7]、肝細胞癌[8]、精神分裂癥[9]等。此外，有證據表明TUBA1B可通過影響免疫細胞的生物學過程參與腫瘤發生發展，如參與結直腸癌患者CD8+T細胞耗竭[10]；影響肝細胞癌患者NK細胞浸潤[11]。

然而，目前TUBA1B在腫瘤發展的機制未得到明確闡述，且缺少其在泛癌中的研究，因此，我們利用癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數據庫和GEO數據庫對TUBA1B進行系統分析，在33種腫瘤中通過表達水平、疾病分期、臨床預后和基因突變特征等方面評估TUBA1B與腫瘤惡性表型的相關性。隨后，我們對TUBA1B相關免疫細胞浸潤水平、免疫相關基因共表達水平進行數據挖掘。最后進行TUBA1B的富集分析，包括相互作用蛋白預測、通路富集分析，通過生物信息學的方法探討TUBA1B參與腫瘤發生發展的可能機制，為基礎研究提供線索。

1 資料與方法

1.1 資料

在TCGA數據庫中提取33種癌癥樣本和相應正常樣本的mRNA表達譜及相關臨床數據，共涉及11 315份樣本。在組織基因譜(Genotype-Tissue Expression，GTEx)中下載31個不同組織的正?；虮磉_數據。將基因表達量進行log2轉化后，對31個正常組織和33個腫瘤組織中的TUBA1B表達水平進行評估并將33個癌癥樣本與配對標準樣本進行比較。

1.2 方法

1.2.1 基因和蛋白表達分析 腫瘤免疫評測網站(Tumor Immune Estimation Resource，TIMER)可分析不同腫瘤的基因表達、免疫浸潤、臨床預后[12]。我們在TIMER2.0網站(http：//timer.cistrome.org/)中檢索TUBA1B，分析TCGA內33種癌癥類型中TUBA1B在腫瘤和癌旁中的表達?；虮磉_分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA2，http：//gepia 2.cancer-pku.cn/)可進行基因相關性、臨床生存和自定義分析[13]。我們利用GEPIA2分析了TUBA1B在TCGA腫瘤中的表達，并將匹配的TCGA癌旁和GTEx正常組織數據作為對照。阿拉巴馬大學伯明翰分校網站(University of Alabama at Birmingham Cancer Data Analysis Portal，UALCAN，http：//ualcan.path.uab.edu)是可利用來自31種腫瘤的轉錄組和臨床資源進行交互式分析的在線網站[14]。在此，分析了TUBA1B在腫瘤和正常樣本中的相對表達，以及TUBA1B表達高低與腫瘤分期的相關性。使用蛋白質組學分析網站(Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium，CPTAC，http：//ualcan.path.uab.edu/analysis-prot.html)分析TUBA1B在腫瘤中蛋白水平的表達情況。

1.2.2 生存預后分析 使用GEPIA2工具進行患者的生存預后分析。在網站中檢索TUBA1B基因。高表達和低表達隊列按高(50%)和低(50%)臨界值劃分。此外，使用Kaplan-Meier工具網站的“泛癌RNA-seq”模塊，高低表達組界限按“最佳cut-off值”分界，評估21種癌癥總體生存期與TUBA1B表達高低的相關性[15]。

1.2.3 基因突變分析 cBioPortal網站(https：//www.cbioportal.org)可用于分析腫瘤多組學數據并做可視化分析[16-17]。本文利用此網站進行了TUBA1B的基因突變分析，包括突變頻率、突變類型、拷貝數改變、突變與生存預后相關性的分析。

1.2.4 免疫浸潤水平分析 使用TIMER2.0在線分析平臺對多種腫瘤免疫浸潤水平評估[12]。在免疫模塊中檢索TUBA1B基因，選擇免疫浸潤類型，在此分析了重要的免疫浸潤細胞和免疫相關基因在多種腫瘤中的相關性。

1.2.5 基因富集分析 通過互作蛋白檢索網站(https：//string-db.org)篩選了TUBA1B的結合蛋白，并進行蛋白-蛋白相互作用網絡的富集分析[18]。使用TIMER2.0分析TUBA1B與不同癌癥類型中TUBA1B結合的12個相互作用因子的相關性。利用GEPIA2篩選出在多種腫瘤中與TUBA1B相似的100個基因，并將這100個基因與STRING網站篩選出的12個基因取交集，得出2個共同基因。利用ShinyGO圖形化基因富集工具分析100個TUBA1B相似基因的富集通路[19]，隨后使用微生信在線網站(https：//www.bioinformatics.com.cn)中的GO、通路氣泡圖將富集結果可視化。

1.2.6 統計學分析 非參數Wilcoxon秩和檢驗應用于組間差異；相關分析使用Spearman相關檢驗；Kaplan-Meier曲線應用于生存預后分析，組間生存率采用Cox檢驗，檢驗水準為α=0.05，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TUBA1B在泛癌中的表達差異分析

進行TUBA1B的泛癌分析包括癌與癌旁表達差異分析、腫瘤TNM分期差異分析、預后差異分析、免疫浸潤分析、基因突變特征分析和富集分析，以探索TUBA1B參與多種腫瘤發生發展的可能機制。本研究使用的數據庫概覽如圖1所示。

圖1 數據庫概覽

為了研究TUBA1B在多種癌與癌旁的表達差異，我們分析了TUBA1B在mRNA水平上的表達差異(圖2A)。結果表明在膀胱尿路上皮癌、宮頸鱗狀上皮細胞癌、結腸癌等16種腫瘤中TUBA1B表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)。

此外，鑒于TIMER2.0數據庫個別腫瘤缺少癌旁數據，我們又利用GTEx數據集作為對照組進行分析，結果表明在彌漫大B細胞淋巴瘤等6種腫瘤中，TUBA1B的mRNA表達高于癌旁(P<0.05，圖2B)。

進一步針對TUBA1B蛋白表達差異展開研究。結果顯示TUBA1B蛋白表達在胰腺癌、肝細胞癌和腎細胞癌中顯著升高(P<0.05，圖2C)。

2.2 TUBA1B在泛癌臨床分期間的表達差異分析

鑒于TUBA1B在多種腫瘤中表達升高，我們進一步探索了TUBA1B與多種腫瘤病理分期之間的相關性。TUBA1B在多種腫瘤的臨床早期即有表達升高，包括頭頸鱗狀細胞癌、胃腺癌、膀胱尿路上皮癌、子宮內膜癌、腎臟乳頭狀細胞癌、侵襲性乳腺癌、肺腺癌、膽管癌、結腸癌、食管癌、宮頸鱗狀上皮細胞癌、肝細胞癌、肺鱗狀細胞癌、甲狀腺癌(P<0.05，圖3A)。而在另一些腫瘤包括腎上腺皮質癌等3種腎臟腫瘤中，TUBA1B的表達隨疾病進展呈升高趨勢(P<0.05，圖3B)。

A：UALCAN數據庫分析TUBA1B與腫瘤臨床早期的相關性；B：UALCAN數據庫分析TUBA1B與腫瘤臨床晚期的相關性。Normal：癌旁組織；Stage：臨床分期；BLCA：膀胱尿路上皮癌；BRCA：乳腺浸潤癌；CESC：宮頸鱗狀上皮癌；CHOL：膽管癌；COAD：結腸癌；ESCA：食管癌；GBM：多形成性膠質細胞瘤；HNSC：頭頸癌；KIRP：腎乳頭狀細胞癌；LIHC：肝癌；LUAD：肺腺癌；LUSC：肺鱗狀細胞癌；STAD：胃癌；THCA：甲狀腺癌；UCEC：子宮內膜樣癌；ACC：腎細胞癌；KICH：腎嫌色細胞癌；KIRC：腎透明細胞癌；TUBA1B：微管蛋白α-1B；UALCAN：阿拉巴馬大學伯明翰分校網站。aP<0.05，bP<0.01。

2.3 TUBA1B表達與泛癌的生存預后分析

分析TUBA1B表達與腫瘤患者生存預后的關系。結果顯示在腎上腺皮質癌、腎嫌色細胞癌、腦低級別膠質瘤、間皮瘤中TUBA1B高表達與較差的總生存期有關(P<0.05，圖4A)。此外，更換預后數據庫進行分析，結果顯示，高表達TUBA1B組在膀胱尿路上皮癌、腎透明細胞癌、侵襲性乳腺癌、腎乳頭狀細胞癌、宮頸鱗狀上皮細胞癌、肝細胞癌、肉瘤、肺腺癌、胰腺癌中預示差的總生存期(P<0.05，圖4B)。

2.4 TUBA1B在泛癌中的突變特征

為了全面展示TUBA1B在腫瘤發生發展中的生物學功能，我們分析TUBA1B在泛癌中的基因突變狀態。結果如圖5A所示，突變類型被分為：堿基突變、結構變異、擴增、深度缺失4種，其中TUBA1B在成熟B細胞腫瘤中突變頻率最高，且最高的突變種類為擴增突變，突變頻率高達4.17%。此外，在腎上腺皮質瘤和精原細胞瘤中同樣觀察到擴增突變為主要突變類型，頻率超過2%。相關性分析表明TUBA1B的擴增突變與其mRNA高表達顯著相關(圖5B)。此外，堿基突變是子宮內膜癌、結直腸癌、膀胱癌、頭頸部腫瘤的主要突變類型，其中子宮內膜癌和結直腸癌中的占比超過1%。膀胱癌中TUBA1B突變患者總體生存期和無進展生存期均較差(P<0.05，圖5C)。

A：TUBA1B在泛癌中的突變頻率；B：TUBA1B表達水平與基因突變類型間的相關性；C：TUBA1B突變與臨床預后的相關性。TUBA1B：微管蛋白α-1B。

2.5 TUBA1B與免疫浸潤的相關性分析

分析TUBA1B與多種免疫細胞浸潤的相關性，TUBA1B與多種腫瘤的腫瘤相關成纖維細胞、髓源性抑制細胞等免疫細胞呈正相關關系，與造血干細胞表達呈負相關(圖6A)。同時，將TUBA1B與免疫相關基因的表達進行相關性分析，重點關注趨化因子、趨化因子受體、免疫激活和免疫抑制相關基因。TUBA1B與多種腫瘤的趨化因子(CCL3、CCL4)，趨化因子受體(CCR3、CCR4)、免疫檢查點(CTLA-4)呈正相關，但在胸腺瘤中，TUBA1B表達與免疫細胞浸潤及免疫分子呈負相關(圖6B～C)。

A：TUBA1B與腫瘤內免疫細胞浸潤能力相關性；B～C：TUBA1B與免疫相關基因相關性。ACC：腎上腺皮質癌；BLCA：膀胱尿路上皮癌；BRCA：乳腺浸潤癌；CESC：宮頸鱗狀上皮癌；CHOL：膽管癌；COAD：結腸癌；DLBC：彌漫性大B細胞淋巴瘤；ESCA：食管癌；GBM：多形成性膠質細胞瘤；HNSC：頭頸癌；KICH：腎嫌色細胞癌；KIRC：腎透明細胞癌；KIRP：腎乳頭狀細胞癌；LGG：腦低級別膠質瘤；LIHC：肝癌；LUAD：肺腺癌；LUSC：肺鱗狀細胞癌；MESO：間皮瘤；OV：卵巢癌；PAAD：胰腺癌；PCPG：嗜鉻細胞瘤；PRAD：前列腺癌；READ：直腸癌；SARC：肉瘤；SKCM：黑色素瘤；STAD：胃癌；TGCT：睪丸癌；THYM：胸腺瘤；UCEC：子宮內膜樣癌；UCS：子宮癌肉瘤；UVM：眼部黑色素瘤。TUBA1B：微管蛋白α-1B。aP<0.05，bP<0.01。

2.6 TUBA1B相關基因的富集分析

為了進一步探索TUBA1B參與腫瘤發生發展中的作用機制，我們分析了與TUBA1B相互作用的結合蛋白，得出與TUBA1B相互作用的12個蛋白(圖7A)。對挖掘出的12個互作蛋白與TUBA1B進行相關性分析，發現驅動蛋白家族2C(kinesin family member 2C，KIF2C)、絲/蘇氨酸蛋白激酶、微管蛋白α-1A鏈、微管蛋白β(β-tubulin，TUBB)、微管蛋白β-2A鏈、微管蛋白-酪氨酸羧肽酶1、微管蛋白酪氨酸羧肽酶2、卵黃羧肽酶與TUBA1B在多種腫瘤中關系密切(圖7B)。隨后對TUBA1B相似基因進行挖掘，將前100個與其相似的基因與其相互作用蛋白進行交集分析，得到TUBB和KIF2C兩個分子(圖7C)，二者與TUBA1B在膀胱尿路上皮癌(KIF2C，r=0.75，P<0.01；TUBB，r=0.69，P<0.01)、侵襲性乳腺癌(KIF2C，r=0.74，P<0.001；TUBB，r=0.60，P<0.01)、結腸癌(KIF2C，r=0.53，P<0.01；TUBB，r=0.56，P<0.01)、食管癌(KIF2C，r=0.72，P<0.01；TUBB，r=0.68，P<0.01)、頭頸鱗狀細胞癌(KIF2C，r=0.69，P<0.01；TUBB，r=0.6，P<0.01)中均有很強的正相關性(圖7D)。

A：TUBA1B相互作用蛋白網絡；B：TUBA1B與相互作用基因的相關性分析；C：TUBA1B相互作用基因和100個相似基因的交聯分析；D：TUBA1B與TUBB、KIF2C的相關性分析；E～F：針對TUBA1B相似基因的KEGG、GO富集分析。ACC：腎上腺皮質癌；BLCA：膀胱尿路上皮癌；BRCA：乳腺浸潤癌；CESC：宮頸鱗狀上皮癌；CHOL：膽管癌；COAD：結腸癌；DLBC：彌漫性大B細胞淋巴瘤；ESCA：食管癌；GBM：多形成性膠質細胞瘤；HNSC：頭頸癌；KICH：腎嫌色細胞癌；KIRC：腎透明細胞癌；KIRP：腎乳頭狀細胞癌；LAML：急性髓系白血??；LGG：腦低級別膠質瘤；LIHC：肝癌；LUAD：肺腺癌；LUSC：肺鱗狀細胞癌；MESO：間皮瘤；OV：卵巢癌；PAAD：胰腺癌；PRAD：前列腺癌；RCC：腎細胞癌；READ：直腸癌；SARC：肉瘤；SKCM：黑色素瘤；STAD：胃癌；TGCT：睪丸癌；THYM：胸腺瘤；UCEC：子宮內膜樣癌；UCS：子宮癌肉瘤；UVM：眼部黑色素瘤；TUBA1B：微管蛋白α-1B；TUBB：微管蛋白β；KIF2C：微管解聚激酶。

隨后對得出的100個TUBA1B相似基因進行富集分析，KEGG通路分析顯示TUBA1B可能通過有絲分裂、微管細胞骨架、細胞周期等參與腫瘤發生發展(圖7E)。GO富集分析則顯示TUBA1B與DNA復制、錯配修復、細胞周期、P53信號通路相關(圖7F)。

3 討論

本文利用來自TCGA數據庫的33種腫瘤數據，通過基因表達差異、分期差異、預后差異、基因突變特征、免疫浸潤和基因富集分析，探索適用于廣譜腫瘤診斷和療效預測的生物標志物。通過單一基因的泛癌分析，我們發現TUBA1B在多種腫瘤中表達顯著上調，并與臨床病理分期和預后有著明顯的相關性，因此進一步探討了其作為腫瘤標志物的臨床價值和致腫瘤發生發展的可能機制。

TUBA1B是微管蛋白家族中的一員，通過與微管蛋白β構成二聚體參與微管形成，發揮細胞運動、分裂、信號傳導、物質運輸等功能。已有多篇文章報道TUBA1B與抗腫瘤藥物作用相關，如針對尼替丁氯抗肝細胞癌的研究顯示，尼替丁氯治療前后組差異表達的circRNA可通過miRNA海綿作用競爭TUBA1B轉錄水平的表達，影響肝癌治療[8]；在尤文肉瘤治療中，TUBA1B基因突變可導致小分子抑制劑產生耐藥性。此外，TUBA1B在肝癌中可作為腫瘤相關骨髓細胞標記基因，預測患者預后和指示免疫浸潤水平[20]。雖然目前已有多篇文章提示TUBA1B密切聯系腫瘤，但在腫瘤起源和進展中的機制未闡明，且缺少泛癌水平的研究分析。

在本研究所涉及的33種腫瘤數據中，TUBA1B在22種腫瘤組織的表達均顯著高于正常組織。遺憾的是，由于數據庫中正常樣本數量過少，TUBA1B在多形性成膠質細胞瘤、肺腺癌、直腸腺癌表達差異分析中的數據無統計學意義。由于數據庫中腎上腺皮質癌、乳腺浸潤癌等缺乏正常樣本，TUBA1B無法在其中分析表達差異。隨著腫瘤正常組織基因表達數據的積累，TUBA1B在泛癌水平的表達分析值得進一步探索。

隨后我們對TUBA1B進行了腫瘤分期差異分析，以探討其作為癌癥早期篩查和疾病進展監測的潛力。結果提示14種腫瘤存在早期TUBA1B表達升高，提示TUBA1B具有作為早癌篩查指標的意義。此外，TUBA1B在3種腎癌晚期表達顯著升高，提示TUBA1B可作為這3種腎臟腫瘤進展的檢測標志物。生存預后分析結果表明TUBA1B高表達與多種腫瘤預后較差相關，綜上反映TUBA1B可作為良好的腫瘤臨床標志物。但預后分析中值得注意的是，GEPIA2與KM plotter預后分析結果存在較大差異，我們通過查閱數據庫原始文獻發現二者在cut-off值的選取模式是不同的。GEPIA2中cut-off值選用的是中位數，KM plotter中的cut-off值根據網站自身算法計算出差異最顯著的cut-off值，兩者選擇的cut-off值未統一，導致高低表達TUBA1B的分群標準不一致，因此我們認為兩個數據庫在預后分析時所得出的結果差異較大可能與cut-off值的設定有關，此外數據來源不同可能也是兩個數據庫對預后分析差異的原因。

通過分析TUBA1B基因表達與腫瘤免疫細胞浸潤水平的關系，我們發現TUBA1B表達與多種免疫細胞浸潤呈現正相關，且既往研究表明TUBA1B的表達與NK細胞浸潤相關[11]、可作為腫瘤相關骨髓細胞標記基因。此外，TUBA1B與免疫相關基因存在顯著正相關性，其中與細胞因子、免疫檢查點關系密切，提示TUBA1B可能成為免疫檢查點抑制劑或細胞因子療效的預測指標。

蛋白互作網絡顯示TUBB和KIF2C在多數癌癥中與TUBA1B較強的正相關性，TUBB基因編碼TUBB蛋白，與TUBA1B編碼的微管蛋白α組裝構成微管。研究表明TUBB與腫瘤發生發展關系密切，表達增加可導致腫瘤細胞對微管靶向藥物的耐受性增加，且其高表達與肺腺癌的低生存率相關[21]；針對髓母細胞瘤的研究發現，TUBB可作為靶點阻斷腫瘤生長[22]。KIF2C編碼有絲分裂著絲粒相關運動蛋白，與KIF18B構成復合物，在有絲分裂中發揮微管解聚活性[23]。KIF2C在多種腫瘤中表達升高，近期有關肝細胞癌的研究顯示KIF2C可溝通Wnt/β-catenin與mTORC1信號通路，給兩種明星通路交聯提供分子基礎，強調了KIF2C作為肝細胞癌治療靶點的潛力[24]。除此之外，KIF2C還可通過調節DNA修復、微管穩定性、免疫細胞浸潤[25]等參與腫瘤的發生發展[26]。綜合以上文獻回顧和本文蛋白互作結果，TUBA1B蛋白互作網絡是癌癥相關的主要網絡之一，與腫瘤的耐藥、轉移、免疫、治療靶點等有著密切的聯系，進一步探究其在腫瘤中的功能可為癌癥治療提供新的線索。

總之，本研究表明TUBA1B可能成為多種腫瘤的獨立預后因素，且其表達在不同分期的腫瘤中存在明顯差異，提示TUBA1B可成為腫瘤早期篩查和晚期進展監測的重要標志物。此外，腫瘤免疫細胞浸潤水平及免疫相關基因分析顯示TUBA1B表達與腫瘤免疫多呈正相關，提示TUBA1B有望成為免疫治療療效的預測標志物或免疫治療潛在靶點。