富血小板纖維蛋白對大鼠骺板軟骨細胞增殖和分化的影響

賈賽雄 利春葉 洪意俠 翁啟文 吳迪 龍海泉 陳金仁

骺板是兒童骨折的好發部位，涉及骺板的骨折存在骨橋形成的風險。為避免骨橋復發，骨橋切除后留下的空腔目前多采用脂肪、骨水泥等填塞，臨床效果不一[1]。組織工程骺板在治療骺板損傷方面雖然取得了一定的實驗效果，但仍存在著諸多問題，比如，支架材料的選擇仍難以滿足多方面要求，外源性的細胞因子價格昂貴限制了其實驗應用。對此，富血小板纖維蛋白 ( platelet-rich fibrin，PRF ) 是否能滿足組織工程骺板的要求呢？PRF 具有三維結構，它既可以作為支架材料又可以產生細胞因子。為此，筆者通過體外實驗，在 PRF 的作用下體外培養骺板軟骨細胞，探討了 PRF 在骺板軟骨細胞增殖、分化以及生物學行為等方面的作用，現報道如下。

材料與方法

一、主要試劑與儀器

icell 原代軟骨細胞培養基 ( 賽百慷公司 )，二甲基砜 ( dimethyl sulfoxide，DMSO ) ( Sigma 公司 )，CCK-8 試劑 ( cell counting kit-8，CCK-8 ) ( 日本同仁 )，COL Ⅱ antibody ( Proteintech 公司 )，細胞糖胺聚糖 ( glycosaminoglycan，GAG ) 總含量二甲基亞甲基藍比色法定量檢測試劑盒 ( Genmed 公司 )，多聚甲醛 ( platelet-rich fibrin，PFA ) ( Solarbio 公司 )，胎牛血清 ( fetal bovine serum，FBS )、Pen Strep、胰酶 ( Gibco 公司 )，Ⅱ 型膠原酶、24 孔板專用細胞爬片、Triton X-100、山羊血清、DAPI 試劑( 4,6-diamino-2-phenyl indole，DAPI ) ( Solarbio 公司 )，Fluoromount-G 熒光封片劑 ( SourthernBiotech 公司 )，低速臺式離心機 ( L550，湘儀公司 )，二氧化碳培養箱 ( Heal Force HF151，上海力申公司 )，熒光倒置顯微鏡 ( Mshot MF53，明美公司 )，酶標儀 ( MR-96A，Mindray 公司 )。

二、實驗方法

1. 骺板軟骨取材及細胞培養：頸椎脫臼法將大鼠 ( 2 周齡 SD 大鼠 4 只，深圳拓普生物提供 ) 處死，超凈臺內無菌條件下去除四肢皮膚、肌肉、骨膜，從股骨遠端及脛骨近端分離骺板軟骨，將骺板軟骨組織剪碎，用磷酸鹽緩沖鹽水 ( phosphate buffered saline，PBS ) 清洗若干次，用 0.1% Ⅱ 型膠原酶與 0.25% trypsin 37 ℃ 水浴震蕩消化 1.5 h。用培養基 ( DMEM / F12 + 10% FBS + 1% P / S ) ( DMEM：dulbecco’s modified eagle medium ) 中和，1000 r / min離心 3 min，收集組織，加入 0.1%、4 ℃ 的 Ⅱ 型膠原酶，置于 37 ℃、5% CO2、飽和濕度 95% 的培養箱中過夜消化，期間每小時震蕩離心管 1 min。

取出過夜消化的組織，吹打若干次，過 100 μm篩網，收集濾液、離心、重懸沉淀。將細胞置于培養皿中，加入 DMEM / F12 + 10% FBS + 1% P / S，置于37 ℃、5% CO2、95% 濕度的培養箱，24 h 后換液。當生長面積達培養皿的 80%～90% 時進行傳代。

2. 細胞形態學觀察：在倒置相差顯微鏡下觀察各代細胞的形態及貼壁情況，記錄軟骨細胞生長狀態和形態變化。

3. 骺板軟骨細胞熒光鑒定：原代細胞爬片后將蓋玻片取出，4% PFA 于 4 ℃ 固定 30 min，PBS 漂洗，破膜封閉液 ( 0.5% Trition X-100 與 PBS 1∶1混合，再加 10% 血清配成 ) 封閉 2 h。加入 Ⅱ 型膠原抗體 ( 與 PBS 1∶100 )，4 ℃ 濕盒孵育過夜。PBS 漂洗，加入四甲基異硫氰酸羅丹明 ( tetramethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC ) 標記的熒光二抗( 1∶50 )，室溫避光孵育 1 h。PBS 漂洗，滴加 DAPI染色液，避光孵育 20 min，滴加 Fluoromount-G 封片，熒光顯微鏡下觀察，采集圖像。

4. PRF 的制備：將 8 周齡的 SD 雄鼠 ( 1 只，深圳拓普生物提供 ) 麻醉，75% 酒精消毒，在超凈臺中剪開腹腔，從腹主動脈取血 10 ml 迅速放入離心管中，采用無菌且不添加任何抗凝或促凝劑的離心管放入離心機中，2000 rpm 離心 10 min，離心后的血液分為三層，中間層呈淡黃色凝膠狀即 PRF，取出后減去尾端帶紅細胞成分置于無菌試管中，稱重后加入 PBS，-80 ℃ 儲存備用。

5. 實驗分組：對照組在培養基中不加 PRF，實驗組在培養基底部加入 PRF 膜。

6. CCK-8 檢測細胞增殖：取第三代細胞培養，當細胞密度達到約 90% 時棄培養基，加入 1 ml 0.25% 胰酶消化至細胞變圓剛要脫落時用完全培養基終止消化，消化計數。以每孔 1800 個細胞接種到96 孔板中，用 PBS 洗滌后，添加含有 10% FBS 的DMEM ( 每孔 200 μl )。每組平行設 6 次重復 ( 即 6 個時間點，每個時間點鋪一塊板 )，每組每次 6 個復孔，將培養板放在培養箱中培養 ( 37 ℃，5% CO2)。

細胞貼壁后記為 0 h，實驗組更換為含 PRF 的培養基，對照組、實驗組分別于細胞貼壁后 0 h、24 h、41 h、48 h、65 h 和 72 h 進行 CCK-8 檢測。檢測時取出 96 孔板，向培養孔分別加入 10 μl CCK-8 溶液，置于培養箱中孵育 1.5 h，用酶聯免疫吸附測定 ( enzymelinked immunosorbent assay，ELISA ) 讀取器測量 450 nm處的吸光度，以此計算相對增殖率。

7. 劃痕實驗檢測細胞遷移：取第三代細胞培養，當細胞密度達到約 90% 時，棄培養基，加入1 ml 0.25% 胰酶消化至細胞變圓剛要脫落時用完全培養基終止消化，消化計數。先用 marker 筆在 6 孔板背后，用直尺均勻劃橫線，每隔 0.5 cm 一道，橫穿過孔。每孔穿過 3 條線。以每孔 50 萬個細胞接種到 6 孔板中，將培養板放在培養箱中培養過夜( 37 ℃，5% CO2)。第 2 天，用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，保證每孔最終統計數據至少 3 個缺口。

用 PBS 洗滌 3 次，去除劃下的細胞，對照組加入無血清的 DMEM / F12 培養基，實驗組加入含PRF 的 DMEM / F12 培養基，放入 37 ℃、5% CO2培養箱。加入培養基時計為 0 h，于 0 h、24 h、48 h 拍照。用 Image J 進行統計分析并進行傷口閉合度評估。傷口閉合度 = [ 間隙面積 ( 0 h ) - 間隙面積 ( Xh ) ] /間隙面積 ( 0 h )。

8. 硫酸 GAG 含量檢測：以每孔 10 萬個細胞鋪6 孔板 4 個孔 ( 每組 2 個孔 )，細胞過夜貼壁后實驗組培養基加入 PRF，處理時間為 24 h 和 48 h。按照細胞 GAG 總含量二甲基亞甲基藍比色法定量檢測試劑盒的方法對待測樣品作預處理，并構建標準曲線：縱坐標 ( Y 軸 ) 為吸光度值，橫坐標 ( X 軸 ) 為標準 GAG 含量。移取 50 μl 上述預處理的待測樣品到 1.5 ml 離心管。按試劑盒方法獲得樣本吸光度值。根據標準曲線獲得樣品消化液中硫酸 GAG 的含量 ( μg / ml )。

三、統計學處理

使用 SPSS 19.0 軟件包對 CCK-8、劃痕實驗、硫酸 GAG 含量檢測結果采用雙因素方差分析 ( two-way ANOVA ) 進行比較，數據均用±s表示，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、細胞形態學觀察

原代細胞鏡下呈球狀，繼續培養后可部分貼壁( 3～4 h )，1 天后大部分軟骨細胞為梭形及多角形，細胞邊緣輪廓清晰，具有折光性，當 80%～90% 的骺板軟骨細胞貼壁后即可進行傳代培養。隨著細胞傳代，細胞增殖速度顯著，變形明顯，梭形為主，邊緣模糊，折光性變弱。

二、細胞免疫熒光鑒定結果

免疫熒光檢測原代骺板軟骨細胞中的 COL Ⅱ 表達，發現熒光強度高，經免疫熒光鑒定，該細胞純度達 90% 以上 ( 圖1 )。

圖1 a、b：直接免疫熒光鑒定 ( × 100 )；c、d：直接免疫熒光鑒定 ( × 200 )Fig.1 a - b: Direct immunofluorescence identification ( × 100 ); c - d: Direct immunofluorescence identification ( × 200 )

三、CCK-8 實驗檢測細胞增殖

與對照組相比，實驗組 PRF 作用 24 h 時，兩組相對增殖率比較差異有統計學意義 (P＜ 0.05 )，實驗組增殖速度較慢；兩組細胞在 41 h 時相對增殖率差異無統計學意義 (P＞ 0.05 )，但實驗組 41 h 與24 h 比較差異有統計學意義 (P＜ 0.05 )，說明 41 h比 24 h 的增殖速度有明顯提高；實驗組 48 h，與本組 41 h 及對照組 48 h 的相對增殖率比較，差異有統計學意義 (P＜ 0.05 )，說明實驗組 48 h 增殖速度顯著升高；實驗組 65 h 與 72 h 比較差異無統計學意義 (P＞ 0.05 )，但與本組 48 h 及對照組 65 h 及 72 h比較，增殖速度顯著升高，差異有統計學意義 (P＜0.05 ) ( 表1 )。

表1 CCK-8 實驗中對照組、實驗組各時間點細胞相對增殖率比較 ( % )Tab.1 Comparison of the relative cell proliferation rates between the control group and experimental group at different time points in CCK-8 experiment ( % )

四、劃痕實驗檢測細胞遷移

對照組與實驗組 24 h 和 48 h 傷口閉合度的兩兩比較，差異均有統計學意義 (P＜ 0.05 )，說明實驗組在 48 h 內隨著 PRF 的持續作用時間增加，細胞遷移速度提高，且較對照組顯著升高 ( 表2 )。

表2 劃痕實驗對照組、實驗組各時間點傷口閉合度比較 ( % )Tab.2 Comparison of wound closure at different time points between the control group and experimental group by scratch test ( % )

五、硫酸 GAG 含量檢測

實驗組 PRF 作用 24 h 時，與對照組相比，兩組之間的 GAG 含量差異無統計學意義 (P＞ 0.05 )；PRF 作用 48 h，實驗組的 GAG 含量顯著升高，與本組 24 h、對照組 24 h 和 48 h GAG 含量比較差異均有統計學意義 (P＜ 0.05 ) ( 表3 )。

表3 硫酸 GAG 含量檢測比較 ( μg / ml )Tab.3 Comparison of GAG content in sulfuric acid ( μg / ml )

討 論

骺板是兒童骨折的好發部位，涉及骺板的骨折存在生長停滯和成角畸形的風險。骺板損傷后期如果出現生長停滯、骨橋形成、成角畸形，則需要手術解決生長停滯及成角畸形的問題。為避免骨橋復發，骨橋切除后留下的空腔該如何處理，國內外對填充物材料的選擇包括組織工程骺板進行了較多研究，效果都不盡如人意。PRF 作為一種天然生物材料引起了廣泛的關注，它可以提供生長因子 ( growth factor，GF )、細胞因子、免疫細胞及干細胞樣細胞，用于免疫調節和組織愈合[2]。

PRF 所含的白細胞不僅在免疫和抗炎中起關鍵作用，而且在傷口愈合過程中也起關鍵作用[3-4]。與一代血小板濃縮物富血小板血漿 ( platelet-richplasma，PRP ) 相比，PRF 為固態，PRP 為液態，PRF 制備簡單、離心過程無需添加其它試劑，很好地避免了過敏反應、免疫排斥、交叉感染等。PRF 的 GF 持續釋放速率較 PRP 慢，至少持續釋放 7 天，長者能達到28 天左右[5]。PRF 均勻的三維網格組織通過緩慢釋放細胞因子，而對組織愈合產生長期影響[6]。Kang 等[7]發現 PRF 的蜂窩結構包含許多小空間，可以容納移植細胞，作為細胞增殖和分化的支架[8]。外源性的細胞因子價格昂貴，PRF 來自于自體，成本低，其血小板濃度高于血液基本水平，在血小板 α 顆粒儲存和釋放的生物活性分子中，包含以下最常用于組織再生的 GF：血小板源性生長因子 ( platelet-derived growth factor，PDGF )，胰島素樣生長因子 ( insulin-like growth factor 1，IGF-1 )，轉化生長因子 β1 ( transforming growth factor-β1，TGF-β1 )，血管內皮生長因子( vascular endothelial growth factor，VEGF )，堿性成纖維細胞生長因子 ( basic fibroblast growth factor，BFGF )和表皮生長因子 ( epidermal growth factor，EGF )[9]。除了富集血小板和白細胞外，還發現在纖維蛋白網絡內具有高再生潛力的干細胞樣細胞[10-11]。國外有研究還證實了血小板來源的 GF 可以刺激軟骨細胞的體外增殖和分化[12-14]，亦可促進軟骨的體內愈合[15-17]。

本研究采用 CCK-8 檢測 PRF 作用下骺板軟骨細胞的增殖情況，由結果可知，24 h 時，實驗組的細胞增殖速度比對照組較慢 (P＜ 0.05 )，實驗組 24 h 之后增殖速度開始加快，兩組細胞在 41 h 的增殖速度達到一致水平 (P＞ 0.05 )，在 48 h 實驗組相比對照組增殖速度顯著變快，之后，實驗組細胞增殖速度更快，在 65 h 達到增殖頂峰，實驗組 72 h 與 65 h 增殖速度無顯著差異 (P＞ 0.05 )。結果表明，PRF 可促進骺板軟骨細胞的增殖，該結果與先前文獻一致[13]。

劃痕實驗是研究細胞遷移的首選方法，它的實驗設計成本低且簡單，實驗條件可控。劃痕實驗涉及在多孔試驗板中培養單層細胞以使其融合。在單層中創建一個“傷口”( 無細胞區域 )，細胞可以遷移到其中，并可以監測劃痕區域的重新定殖以量化細胞遷移。本研究采用劃痕實驗檢測 PRF 對于骺板軟骨細胞遷移的影響，結果提示，實驗組在 48 h 內隨著 PRF 的持續作用時間增加，細胞遷移速度提高，且較對照組顯著升高。說明 PRF 可以明顯促進骺板軟骨細胞的遷移。

GAG 是由重復雙糖組成的線狀多糖，根據其雙糖單位可分為硫酸軟骨素 ( chondroitin sulfate，CS )、硫酸皮膚素 ( dermatan sulfate，DS )、硫酸肝素 ( heparin sulfate，HS ) 和肝素。這種結構多樣性在骨骼組織的發育、生長和穩態等一系列生物學功能中起著重要作用，是評價軟骨功能的重要指標[18]。本研究采用二甲基亞甲藍比色法對 GAG 進行測定，結果說明在24 h 內 PRF 并沒有對 GAG 的產生起到明顯作用，但在之后明顯促進了 GAG 的產生，在 PRF 的作用下 48 h 時實驗組的 GAG 含量明顯增多。

由以上結果可見，細胞 24 h 的增殖與遷移趨勢結果不太一致，在增殖實驗中，24 h 對照組的增殖速度快，實驗組 24 h 增殖速度反而沒有那么快；而在遷移實驗中，24 h 實驗組細胞遷移速度更快?？赡茉颍阂皇菍嶒灲M 24 h PRF 暫時只影響到了細胞遷移，對增殖影響不明顯，細胞增殖快并不代表遷移也快；二是遷移實驗用的血清濃度和增殖實驗的血清濃度不一樣，高血清濃度使得對照組的細胞增殖速度加快。

根據實驗結果得出，PRF 不僅可以促進骺板軟骨細胞增殖分化，還可以促進 GAG 的產生。但本研究也存在其缺陷，CCK-8 增殖實驗由于實驗組 65 h與 72 h 細胞增殖速度無顯著差異，那么 72 h 后細胞增殖速度是怎樣變化的呢？劃痕實驗及 GAG 測定的時間太短，僅有 48 h，在 48 h 后 PRF 起到的作用如何也尚不確定。故仍需進一步探索。

綜上所述，自體 PRF 具有良好的生物降解性和相容性，富含高濃度的血小板、多種 GF、纖維蛋白原和免疫細胞，在組織工程中既含有細胞因子，又可作為生物支架材料。本研究旨在 PRF 作用下對大鼠骺板軟骨細胞進行體外培養，為進一步探討構建組織工程骺板軟骨做準備，為骺板損傷治療提供新的思路。