紫鉚花素對人黑色素瘤細胞A375 與人永生化角質形成細胞HaCaT 共培養細胞生物學活性的影響*

高 莉，譚 雪，羅靜鶯，閆 明

（新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所新疆維吾爾醫方劑學重點實驗室，新疆烏魯木齊 830011）

小眼畸形相關轉錄因子（MITF）是黑色素細胞生長的主要調節器，調控黑色素生成的3 個關鍵酶［酪氨酸酶（TYR），以及其相關蛋白1，2（TRP-1，2）］［1-2］。角質形成細胞來源的干細胞因子（SCF）及其受體c - Kit 可激活MITF雙重磷酸化，調節雙重激活和降解，進而影響黑色素細胞的生長和分化［3-4］。中藥驅蟲斑鳩菊具有激活TYR活性、提高黑色素合成能力、調節免疫等功能［4］，臨床主要用于治療白癜風［5］。前期研究發現，驅蟲斑鳩菊的活性成分紫鉚花素能激活黑色素細胞TYR活性和增強黑色素合成能力［6］，促進角質形成細胞分泌促黑色素細胞激素（MSH）、SCF等因子［7］，表明紫鉚花素可能通過調控黑色素細胞和角質形成細胞的相互作用促進黑色素合成?；诖?，本研究中擬進一步考察紫鉚花素對人黑色素瘤細胞A375與人永生化角質形成細胞HaCaT共培養細胞生物學活性的影響，并探討其相關機制?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：SQP 型電子分析天平（德國Sartorius 公司，精度為0.1 mg）；YJ-875型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；MCO - 18AIC 型CO2培養箱（日本Sanyo公司）；SPX-150B-Z 型生化培養箱（上海博遠實業有限公司）；Multiskan Go 1510 型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；FC500型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）；CFX96型熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad 公司）；OMKS001 型電泳儀、20150168 型凝膠成像系統（上海伯樂生命醫學產品有限公司）。

試藥：紫鉚花素（新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所自制，批號為20151208，含量≥95%）；DMEM 干粉培養基（美國Gibco 公司，批號為1645780）；胎牛血清（美國HyClone公司，批號為NZJ1221）；四甲基偶氮噻唑藍（MTT，美國Amresco 公司，批號為YY11351）；二甲基亞砜（DMSO，天津市光復化工研究所，批號為D5879）；左旋多巴（美國Sigma 公司，批號為LC0922B5011J）；JC- 1 線粒體膜電位檢測試劑盒（批號為3242985），碘化丙啶（PI）細胞周期檢測試劑盒（批號為6051571），均購自美國BD 公司；TRP-1，TRP-2，MITF，SCF，c-Kit抗體（美國Abcam 公司，批號分別為ab235447，ab221144，ab303530，ab64677，ab283653）；水為純化水。

細胞：人黑色素瘤細胞A375（中國科學院上海生科院細胞資源中心）；人永生化角質形成細胞HaCaT（武漢大學中國典型培養物保藏中心）。

1.2 方法

共培養細胞的建立：取對數生長期的HaCaT 細胞適量，加0.25%胰酶消化，以5×105個/mL 接種于6 孔板中，5%CO2、37 ℃條件下培養6 h使細胞充分貼壁；取對數生長期的A375 細胞適量，同上處理并接種于同一6孔板中（2種細胞的接種比例為2∶1），置5%CO2、37 ℃條件下過夜培養，得共培養細胞。

分組及給藥：取共培養細胞適量，用3.0 mL 0.25%胰酶消化，以5×104個/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，置37 ℃、5%CO2條件下培養過夜，棄去培養基，設對照組（等體積培養液），紫鉚花素（以DMSO溶解制成質量濃度為100 g/L的貯備液）低、中、高劑量組（以下簡稱低、中、高劑量組，0.5，1.0，5.0 μg/L），各組細胞進行相應處理（每孔200 μL），繼續培養48 h。

細胞活性：采用MTT 法。在“分組及給藥”項下分組的基礎上，加設空白對照組（無細胞，等體積培養液），每組設8個復孔，培養44 h時加入5 g/L MTT 20 μL，繼續培養4 h，棄去上清液，加入DMSO 200 μL，振蕩10 min，采用酶標儀于490 nm 波長處測定吸光度（A），并計算細胞增殖率。細胞增殖率（%）=（A給藥組-A空白對照組）/（A對照組-A空白對照組）×100%。

細胞周期：取共培養細胞適量，置25 cm2細胞培養瓶中培養，同“分組及給藥”項下操作，每組設3個復孔。培養48 h，吸出原培養基，以1 mL 胰酶消化，用原培養液緩慢吹下所有細胞，移入4 mL 離心管，1 000 r/ min離心10 min（下同）后棄去培養液，加入1 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸細胞后離心，重復清洗3 次。以1 mL 75%乙醇重懸細胞，4 ℃固定過夜后，離心，棄去固定液，加入1 mL預冷PBS重懸細胞后離心，重復清洗3次，加入500 μL PI/核糖核酸酶（Rnase）染液，37 ℃避光染色15 min，200 目尼龍濾網濾過，采用PI 細胞周期檢測試劑盒，以流式細胞儀檢測。

細胞線粒體膜電位：取共培養細胞適量，按“細胞周期”項下分組、給藥及處理，得到細胞（至“重復清洗3 次”時止）。各管加入500 μL JC-1 工作液，37 ℃孵育15 min，加入1 mL Assay Buffer 混勻，1 000 r/ min 離心10 min；棄去上清液（重復1 次），再加入500 μL Assay Buffer 重懸細胞，200 目尼龍濾網濾過，采用JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒，以流式細胞儀檢測。

mRNA表達：采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）法。取共培養細胞適量，同“細胞周期”項下分組、給藥、處理（至用原培養液緩慢吹下所有細胞止）。用Trizol 法提取細胞的總RNA；取5 μL 進行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA 的完整性，使用反轉錄酶進行反轉錄PCR 合成cDNA 并純化，進行RNA 電泳并檢測濃度，最后以qPCR法檢測SCF，c-Kit，MITF的mRNA表達水平。

蛋白表達：采用Western blot 法。取共培養細胞適量，同“細胞周期”項下分組、給藥、處理（至用原培養液緩慢吹下所有細胞止），以裂解法提取總蛋白，檢測蛋白含量；取變性后蛋白50 μg，進行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜、封閉、洗膜，分別加入β - actin，TRP - 1，TRP -2，SCF，c-Kit，MITF的抗體（1∶1 000，V/V），4 ℃孵育過夜；洗膜5 min，加入二抗（1∶2 000，V/V），室溫孵育2 h，進行化學發光反應后成像，采用Image J 1.5.1軟件分析，檢測目標蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 細胞活性

與對照組［（100±2.89）%］比較，中、高劑量組細胞增殖率［（110.47±5.71）%、（117.74±4.32）%］均顯著升高（P＜0.01）；低劑量組細胞的增殖率為［（90.70 ±5.71）%］。

2.2 細胞周期

與對照組比較，各劑量組細胞G0/G1期細胞比例顯著降低（P＜0.01），S 期和G2/ M 期細胞比例均顯著升高（P＜0.01）。詳見表1和圖1。

A. 對照組 B. 低劑量組 C. 中劑量組 D. 高劑量組圖1 細胞周期圖（±s，n=3）A.Control group B.Low - dose group C.Medium - dose group D.High - dose groupFig.1 Cell cycle（X ± s，n = 3）

表1 各組細胞的周期分布及高線粒體膜電位比例比較（±s，%，n=3）Tab.1 Comparison of cell cycle and proportion of cells with high mitochondrial membrane potential in each group（X ± s，%，n = 3）

表1 各組細胞的周期分布及高線粒體膜電位比例比較（±s，%，n=3）Tab.1 Comparison of cell cycle and proportion of cells with high mitochondrial membrane potential in each group（X ± s，%，n = 3）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。圖3、圖4同。Note：Compared with those in the control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01（for Tab.1 and Fig.3 - 4）.

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2.3 細胞線粒體膜電位

與對照組比較，各劑量組細胞高線粒體膜電位細胞比例均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。詳見表1和圖2。

2.4 SCF，c-Kit，MITF mRNA 及蛋白表達水平

與對照組比較，各劑量組細胞SCF，c-Kit，MITF的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。詳見圖3。

2.5 TRP-1 和TRP-2 蛋白表達水平

與對照組比較，各劑量組細胞的TRP-1和TRP-2蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。詳見圖4。

3 討論

在機體毛囊中，黑色素細胞能生成黑色素，然后通過樹突遞送至表皮角質形成細胞進行表皮色素沉著，其分化和色素沉著依賴于SCF/ c - Kit 信號通路［8］。SCF/c - Kit 信號激活可增強MITF 的磷酸化和轉錄活性［9］。MITF 參與黑色素合成和色素沉著信號傳導，是黑色素細胞色素沉積的主要調節因子，參與黑色素細胞的生長、分化和存活，其通過調節TYR 蛋白家族（包括TYR，TRP-1，TRP-2）參與優黑素生成［10-11］。

本研究中構建了能更好地模擬黑色素細胞體內生存環境［12］的A375 細胞和HaCaT 細胞共培養細胞體系，結果發現，中、高劑量組細胞的增殖率顯著升高，各劑量組G0/G1期細胞比例均顯著降低，S期和G2/M期細胞比例均顯著升高，0.5 μg/mL的紫鉚花素不能顯著升高細胞的增殖率，但能顯著縮短細胞周期，提示0.5 μg/mL的紫鉚花素可能通過調節細胞周期提高細胞增殖率，但由于質量濃度較低可能效果較弱，在48 h 的作用周期內，其促細胞增殖成效還未顯現。各劑量組細胞的高線粒體膜電位細胞比例均顯著升高，TRP - 1，TRP - 2蛋白表達水平及SCF，c - Kit，MITF 的mRNA 和蛋白表達水平均顯著升高，表明紫鉚花素可促進細胞增殖，調節細胞周期，調節細胞線粒體膜電位，保護線粒體功能，抑制細胞早期凋亡的發生，與前期研究［6-7，13-14］的結果一致，也表明紫鉚花素能調節SCF/c- Kit/MITF信號通路，進而影響共培養細胞的生物學活性。

綜上所述，紫鉚花素可能通過調節SCF和c-Kit的表達而影響A375 細胞與HaCaT 細胞共培養細胞的增殖、細胞周期和線粒體膜電位等細胞生物學活性。