丹參-當歸治療缺血性腦卒中作用機制網絡藥理學研究*

王 紅，蔣 征，劉 玲，付媛媛，崔永偉，瞿 城△

（1. 江蘇省中西醫結合醫院南部院區·南京市溧水區中醫院藥學部，江蘇南京 211200； 2. 揚州大學醫學院附屬醫院藥學部，江蘇南京 211200； 3. 南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京 210046）

缺血性腦卒中（CIS）常表現為平衡或協調能力的喪失、口眼喎斜、言語困難，甚至突然暈倒，意識障礙等［1］。由于溶栓時間窗及溶栓風險等原因，西醫治療存在一定局限。中醫稱CIS 為“中風”，認為瘀血存在于中風發生的各個時期，血虛血瘀是中風發病過程中的致病因素，現代中醫多從該角度來治療，如使用活血化瘀藥治療能取得良好效果［2-3］。丹參-當歸藥對為常見的活血化瘀類藥物，兩者一溫一涼，相使配伍，具有活血化瘀、益氣強心、通脈止痛功效，常用于治療血瘀血虛諸證，也是經典復方活絡效靈丹的重要組方藥材［4］?，F代藥理學研究表明，丹參主要含有丹酚酸類、丹參酮類成分，具有保護心腦血管系統、抗炎、抗氧化、清除自由基等藥理作用［5］；當歸中主要含有揮發油、有機酸類成分，能保護心腦血管、增強造血功能、提高免疫功能等藥理作用［6］。王燦等［7］研究發現，補虛藥（當歸）及活血化瘀藥（丹參）出現頻次較高；王佳楠［8］的研究發現，丹參、當歸為對腦卒中治療效果影響較大的核心藥物。但由于中藥成分和治療靶點的多樣性與復雜性，丹參-當歸治療CIS 的藥效物質、生物過程及分子機制尚未明晰。網絡藥理學可通過構建“藥物- 疾病- 靶點- 通路”網絡預測藥物治療疾病的作用機制［9］，符合中醫治病的整體觀念與辨證論治特點，與中藥多成分、多途徑、多靶點的作用機制相吻合。分子對接技術可為探究中藥藥效物質基礎和作用機制提供可行的思路與方法［10］。因此，本研究中采用中藥網絡藥理學，篩選丹參-當歸中的活性成分，預測治療CIS的作用靶點及信號通路，并以分子對接技術進行驗證，為治療CIS 的藥物研發和指導臨床用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 活性成分篩選和作用靶點預測

檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），設置口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18，獲取丹參和當歸的主要活性成分及作用靶點，并通過PubMed、中國知網等數據庫查詢文獻補充活性成分及其作用靶點，使用Swiss TargetPrediction 數據庫補充各活性成分的作用靶點。以Uniprot 蛋白質數據庫（http：//ebi14.uniprot.org）對所有靶點信息進行標準化和去重。

1.2 CIS 疾病靶點的獲取

利用人類基因數據庫（GeneCards，http：// www.genecards.org）、人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，http：//www.omim.org）、DisGeNET（http：//www.Disgenet.org/）數據庫，以“Cerebral ischemic stroke/ CIS”或“cerebral infarction/ CI”為關鍵詞，檢索CIS 的潛在靶點。匯總各數據庫獲得的疾病靶點，去重后得到CIS疾病靶點。

1.3 共有靶點的獲取與蛋白相互作用（PPI）網絡構建

將1.1項下篩選得到的活性成分作用靶點與1.2項下篩選的CIS 疾病靶點取交集，即得丹參- 當歸治療CIS 的共有靶點，并利用Venny 2.1.0 工具制作維恩圖。將共有靶點上傳至String 11.0 平臺，生物種類選定“homo sapiens”，選擇高度可信（high confidence）的互相作用閾值（設為0.9），默認其他設置，所得靶點通過Cytoscape 3.2.8進行可視化處理，構建PPI網絡。

1.4 疾病-藥物-活性成分-靶點網絡構建

運用Cytoscape 3.8.2 軟件將獲得的數據進行可視化處理，構建丹參-當歸治療CIS的疾病-藥物-活性成分-靶點的可視化網絡。在可視化網絡中，每個數據即為1 個節點，其度（Degree）值越高參與度越高，可信性越強。

1.5 富集分析

將共有靶點導入DAVID 數據庫，分別進行基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。功能富集通過細胞成分（CC）、生物學過程（BP）、分子功能（MF）3 個維度來解釋和注釋基因，篩選條件為P＜0.01；根據通路富集結果獲得相應的P值，選擇P≤0.01 作為聚類標準，篩選排名前25 的通路。最后將丹參-當歸治療CIS 的核心靶點、核心靶點密切相關的活性成分及KEGG 富集得到的通路導入Cytoscape 3.8.2 軟件中，構建活性成分- 核心靶點-通路網絡。

1.6 分子對接

采用AutoDock Tools 軟件對疾病- 藥物- 活性成分-靶點網絡中度值排名前6 的靶點蛋白和活性成分進行分子對接驗證。首先通過PubChem 數據庫和Chem-BioOffice 軟件獲得活性成分的3D 結構，并將其保存為.mol2 格式；其次運用PDB（http：//www.rcsb.org/）數據庫檢索核心靶點的3D 結構，利用PyMOL 軟件去除水分子，分離得到的蛋白及配體經Autodock 軟件處理保存為. pdbqt 格式；最后使用Autodock Vina 軟件進行分子對接。

2 結果

2.1 丹參-當歸藥對活性成分及作用靶點篩選

共檢索到活性成分82 個，其中丹參65 個、當歸17 個，詳見表1。丹參對應716 個靶點，當歸對應401 個靶點，去除重復靶點，得到潛在作用靶點787個。

表1 丹參-當歸的活性成分Tab.1 Active ingredients of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Angelicae Sinensis Radix

2.2 共有靶點篩選

檢索GeneCards 數據庫得CIS 疾病靶點752 個，OMIM 數據庫131 個，DisGeNET 數據庫10 個，去重后得671個，丹參-當歸治療CIS的共有靶點76個，詳見圖1。

圖1 丹參-當歸活性成分作用靶點與CIS潛在靶點維恩圖Fig.1 Venn diagram of targets of active ingredients in Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Angelicae Sinensis Radix and potential targets of CIS

2.3 疾病-藥物-活性成分-靶點網絡構建

疾病-藥物-活性成分-靶點網絡見圖2（圖中，圓形代表藥物與疾病的共有靶點，其中紫色代表丹參與當歸共同作用的靶點；菱形代表活性成分）。該網絡由232個節點和1 016條邊組成，其中節點分別包括148個靶點、2 種藥物和82 種活性成分。以度值作為判別重要成分的指標，使用Cytoscape 中的Network Analyzer 工具分析網絡拓撲參數，關聯靶點數排名前6的活性成分為丹參醇B（丹參）、丹參新醌D（丹參）、木犀草素（丹參）、阿魏酸（當歸）、藁本內酯（當歸）、丹參酮ⅡA（丹參）。

2.4 PPI 網絡構建及核心靶點分析

共有111 個節點和544 條邊代表靶點間的相互作用關系，平均度值為4.99，PPI 網絡見圖3。根據度值將核心靶點進行排序，初步得到丹參-當歸治療CIS中發揮重要作用的前10 個靶點為MAPK14，MAPK1，AKT1，PTGS2，EGFR，JAK2，VEGFA，ITGB3，MAPK3，ESR1。

A. 三維圖 B. 二維圖圖3 丹參-當歸治療CIS的共有靶點PPI網絡A.Three - dimensional diagram B.Two - dimensional diagramFig.3 PPI network of common targets of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Angelicae Sinensis Radix in the treatment of CIS

2.5 富集分析

GO功能富集：共獲得2 545個條目。其中BP 2 244個，CC 128 個，MF 173 個；各選取排名前10 的條目進行可視化分析，結果見圖4。其中BP 主要涉及對脂多糖的反應，對細菌來源分子的反應，細胞對化學應激的反應，對氧氣水平的反應，化學突觸傳遞的調節等；靶點蛋白主要存在于膜筏、膜微區、膜區、囊泡腔等CC 中；與內肽酶、絲氨酸水解酶、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶、金屬離子跨膜轉運器、通路的活性及蛋白酶、磷酸酶、生長因子、酰胺的結合等MF關系密切。

圖4 丹參-當歸治療CIS的GO功能富集分析柱狀圖Fig.4 Histogram of GO functional enrichment analysis of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Angelicae Sinensis Radix in the treatment of CIS

KEGG 通路富集：共得到152條信號通路，根據P值按篩選前25 個通路制作氣泡圖，結果見圖5?？梢?，丹參-當歸藥對可能通過PI3K-Akt信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、鈣信號通路、Rap1 信號通路、神經活性配體-受體相互作用等發揮治療CIS 的作用?；钚猿煞?核心靶點-通路網絡見圖6（圖中，菱形代表活性成分，平行四邊形代表作用靶點，其他節點代表信號通路）。丹參- 當歸藥對治療CIS 是多種活性成分作用于多個靶點并參與不同信號通路的結果。

圖5 丹參-當歸治療CIS的KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble chart of KEGG pathway enrichment analysis of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Angelicae Sinensis Radix in the treatment of CIS

圖6 丹參-當歸治療CIS的活性成分-核心靶點-通路網絡Fig.6 Network of active ingredient - core target - pathway of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Angelicae Sinensis Radix in the treatment of CIS

2.6 分子對接

一般認為，受體和配體的結合能數值越小，兩者結合越牢固，化學性質越穩定。當結合能小于-5.0 kcal（-20.92 kJ/mol）時，兩者之間有較好的結合活性；當結合能小于-7.0 kcal（-29.29 kJ/mol）時，兩者之間有強烈的結合活性［11］。將度值排名前6 的核心靶點與關聯靶點數排名前6的活性成分進行分子對接，發現丹參-當歸藥對中的活性成分與對應的核心靶點均有較好的結合活性，詳見表2、圖7。

A.MAPK14 - 丹參酮ⅡA B.MAPK1 - 丹參醇B C.AKT1 - 藁本內酯 D.PTGS2 - 木犀草素 E.EGFR - 丹參醇B F.JAK2 - 丹參酮ⅡA圖7 丹參-當歸治療CIS活性成分與核心靶點的分子對接模式圖A.MAPK14 - tanshinone ⅡA B.MAPK1 - tanshinol B C.AKT1 - ligustilide D.PTGS2 - luteolin E.EGFR - tanshinol B F.JAK2 - tanshinone ⅡAFig.7 Molecular docking between active ingredients and core targets of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Angelicae Sinensis Radix in the treatment of CIS

表2 丹參-當歸活性成分與核心靶點的分子對接信息Tab.2 Molecular docking between active ingredients and core targets of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Angelicae Sinensis Radix

3 討論

CIS 的病因病機較復雜，涉及神經炎癥、能量衰竭、細胞凋亡及自噬等，且各環節相互影響，重疊發生，導致了疾病過程的復雜性。丹參、當歸為常見的活血化瘀藥材，是張錫純《醫學衷中參西錄》中活絡效靈丹的重要組成部分，具有活血化瘀、通絡止痛功效，可用于腦血栓形成、心絞痛等疾病的治療［12］。

本研究表明，按共有靶點統計，丹參醇B、丹參新醌D、木犀草素、阿魏酸、藁本內酯、丹參酮ⅡA對應的靶點較多，考慮為丹參-當歸治療CIS的關鍵活性成分。其中，木犀草素具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等藥理作用，能抑制神經細胞變性，減輕運動和感覺功能障礙。體外試驗表明，木犀草素能緩解小膠質細胞激活引起的神經細胞活力減弱，防止氧化應激引起的內皮細胞損傷［13］。劉亞鷺等［14］在大腦中動脈栓塞模型大鼠中發現，阿魏酸在缺血前后、缺血再灌注等不同時間點均能減小梗死區面積，明顯下調膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、線粒體Bcl2關聯X蛋白（Bax）和半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的表達，調控P38 MAPK/p90RSK/CREB/Bcl-2 信號通路，對抗腦神經細胞凋亡。高娟等［15］發現，藁本內酯可顯著改善卒中患者的神經功能缺損，并促進卒中后神經再生。吳倩等［16］通過建立氧糖剝奪/復糖復氧OGD/R損傷后HT22細胞模型發現，藁本內酯逆轉了細胞模型內活性氧（ROS）的釋放、鈣離子超載及線粒體膜電位的下降等。徐璇等［17］研究發現，丹參酮ⅡA可增強腦缺血模型大鼠磷酸酯酶與張力蛋白同源物（PTEN）的表達，抑制自噬通路PI3K/Akt/mTOR 的表達，起到保護腦組織的作用。丹參醇B和丹參新醌D同屬丹參中的二萜類化合物，但其藥理作用研究遠少于同類成分丹參酮ⅡA，缺少相應的文獻考證。

PPI網絡拓撲分析篩選出的核心靶點包括MAPK14，MAPK1，AKT1，PTGS2，EGFR，JAK2，VEGFA 等。其中，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號途徑普遍存在于生物體內的大多數細胞中，與細胞的增殖、分化、存活、凋亡等生理過程密切相關，MAPK 的異常已被證實能導致多種神經系統疾病。MAPK14 能控制炎癥進展，可阻止促炎細胞因子分泌，并控制抗氧化基因的表達［14，18］。MAPK1 又稱ERK2，ERK2 的磷酸化在神經軸突和樹突狀細胞的生長和穩定中起重要作用，腦缺血會導致ERK 的時間依賴性激活，而上游MEK 的抑制則會導致損傷區炎性細胞因子和細胞凋亡的顯著降低［19］。蛋白激酶B（AKT1）在調節代謝、促進血管生成，調節血管內皮細胞功能等方面發揮重要作用，能被多種上游細胞因子激活，從而對缺血性損傷后的神經細胞發揮保護作用［20］。PTGS2 是能催化花生四烯酸轉化為前列腺素的類過氧化物酶，是重要的炎性介質，參與炎癥初期到炎癥形成的全過程，PTGS2的過量表達可破壞內環境平衡，參與腦損傷后的炎性反應，并促進腦梗死面積的擴大［21］。表皮生長因子受體（EGFR）屬酪氨酸家族激酶受體，EGFR 通過其細胞內結構域介導細胞對生長因子的反應。在大腦中動脈同側皮質梗死區神經細胞和巨噬細胞/小膠質細胞亞群中，EGFR明顯上調，可能參與了缺血性和創傷性腦損傷后神經細胞的可塑和修復機制［22］。血管內皮生長因子A（VEGFA）是血管內皮生長因子（VEGF）家族中神經保護的重要生長因子，能促進腦缺血后的血管生成。CHEN等［23］發現，當VEGFA表達水平升高時，神經干細胞、神經細胞和星形膠質細胞的數量也隨之增加。

GO 富集分析結果表明，關鍵靶點主要分布于膜筏、膜區、囊泡腔、質膜外側，靶點中主要描述了內肽酶、絲氨酸水解酶、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶等在分子水平上的活性。同時，主要靶點涉及了對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、細胞對化學應激的反應、對氧氣水平的反應等多個生物學過程。在KEGG富集分析中，PI3K -Akt 信號通路與丹參- 當歸藥對治療CIS高度相關，其在抗神經細胞凋亡、氧化應激、炎性反應及自噬中發揮重要作用［24］。如PI3K/Akt信號通路的激活可抑制NF - κB 引起的促炎因子的表達，抑制細胞介導的神經炎癥，促進M1 型（促炎表型）小膠質細胞向M2 型（抗炎表型）轉化，減輕炎性反應［25］；能發生一系列磷酸化級聯反應，延緩細胞凋亡；活化的Akt 可進一步激活氧化應激中的關鍵調節因子，阻止Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白-1與其耦聯，增加抗氧化蛋白的表達；通過激活PI3K/Akt信號通路的下游靶點mTOR，減少細胞的過度自噬與腦損傷的程度，保護缺血腦組織［26］。故丹參-當歸可能通過多種途徑調節PI3K/Akt信號通路改善CIS的臨床癥狀，但仍需進一步驗證。

分子對接技術發現，篩選的6個活性成分與核心靶點MAPK14，MAPK1，AKT1，PTGS2，EGFR，JAK2 的結合能均小于- 5.0 kcal，表明其具有較好的結合活性。其中，丹參醇B 與EGFR、丹參新醌D 分別與MAPK14，PTGS2，JAK2，木犀草素分別與PTGS2，EGFR，藁本內酯分別與MAPK14，AKT1，JAK2，丹參酮ⅡA分別與MAPK14，AKT1，PTGS2，EGFR，JAK2 的結合能均小于等于- 7.0 kcal，強于原始配體的結合活性，表明這些活性成分與其對應的靶點的結合活性強。

綜上所述，丹參- 當歸可能通過丹參醇B、丹參新醌D、木犀草素、阿魏酸、藁本內酯、丹參酮ⅡA等活性成分，作用于MAPK14，MAPK1，AKT1，PTGS2，EGFR，JAK2 等關鍵靶點，繼而調節炎性反應、氧化應激、抗神經細胞凋亡和自噬等生物學過程，調控PI3K/Akt 等主要的信號通路而發揮抗腦缺血損傷的作用。