類風濕關節炎生物標志物開發及潛在治療中藥預測*

張 琳，毛 偉，劉 芳，枉 前，呂 軍△

（1. 中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院，重慶 400038； 2. 重慶市南岸區人民醫院，重慶 400060）

類風濕關節炎（RA）屬全身性難治性自身免疫性疾?。?］，最終可導致關節畸形和功能喪失［2］，可并發肺部疾?。?］、心血管疾?。?］、惡性腫瘤、抑郁癥等［5］。不僅會造成患者身體機能、生活質量和社會參與度下降，也給患者家庭和社會帶來了巨大的經濟負擔。迄今為止，其病因及具體發病機制尚未完全明確。故RA 早期的診斷具有重要意義。部分生物標志物已被常規用于RA 的診斷和治療［6］，但仍不能滿足臨床實踐和藥物開發的需求。有研究發現，免疫功能紊亂與RA 的發病密切相關［7］。以T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞為代表的免疫細胞參與并介導RA 的自身免疫反應，誘導細胞因子、趨化因子擾亂免疫系統平衡，進而加快軟骨和骨侵蝕［8］。因此，從免疫細胞浸潤的角度研究RA的發病機制是目前RA 研究的熱點和發展趨勢［9］，對于開發新的免疫治療靶點具有重要價值?；诖?，本研究中利用生物信息學的方法探索RA 的生物標志物，并預測可能用于治療RA 的中藥，為今后診斷和治療RA 提供新思路?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：DS-11FX+超微量/熒光分光光度計（美國Denovix公司）。

試藥：Trizol 試劑盒（天根生化科技＜北京＞有限公司，批號為DP424）；TaKaRa PrimeScriptTM反轉錄聚合酶鏈反應（RT - PCR）試劑盒（日本TaKaRa 株式會社，批號為RR092A）；蛋白酶抑制劑（批號為ST506）、RIPA裂解緩沖液（批號為P0013B）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，批號為A0208），均購自美國Beyotime Biotechnology 公司；BCA 試劑盒（廣州碩譜生物科技有限公司，批號為BL521A）；Dulbecco改良Eagle培養基（美國Gibco公司，批號為C11995500BT）；兔抗細胞骨架相關蛋白2（CKAP2）多克隆抗體（英國Abcam 公司，批號為ab227214）。

細胞：人成纖維細胞樣滑膜細胞系（MH7A），購自中國科學院上海細胞生物研究所。

1.2 患者（基因）收集

選擇GPL96 平臺的3 個數據集GSE55235，GSE55457，GSE55584 收集患者滑膜組織基因表達情況。共收集到33例RA患者，20例健康者，分別納入RA組和HC組。其中3個數據集分別含RA患者、健康者各10例；RA患者13例，健康者10例；RA患者10例。

1.3 基因篩選與分析

數據獲取與差異表達基因的篩選：在Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫以“rheumatoid arthritis”“synovial”為關鍵詞檢索人類mRNA 表達譜。以前述3 個數據集聯合分析，采用GPL8300 平臺的GSE10500 數據集和GPL570 平臺的GSE77298 數據集（分別采自滑液的巨噬細胞和滑膜組織分別含RA 患者5 例、健康者3 例和RA 患者16 例、健康者7 例）進行外部驗證。利用limma R 包以adjustedP＜0.05，|log2FC|＞1 為條件篩選差異表達基因（DEGs）。

加權基因共表達網絡（WGCNA）的構建：計算整合后的數據集中每個基因的中位數絕對偏差，選取其中最大的5 000 個基因構成表達矩陣。利用WGCNA 包進行層級聚類，計算軟閾值，并構建共表達網絡。

核心基因與生物標志物的篩選：將與臨床癥狀相關性最高的模塊基因導入Cytoscape 3.7.1 軟件，利用MCODE 插件篩選得分最高模塊。將模塊中的基因進行單因素邏輯回歸，篩選P＜0.05 的基因為核心基因。以數量7∶3隨機分為訓練集和測試集。訓練集使用隨機森林遞歸特征消除（RF-RFE）、支持向量機遞歸特征消除（SVM-RFE）2種算法進行特征選擇，重疊基因即為RA的生物標志物。使用GSE10500 和GSE77298 進行外部驗證。

基因集富集分析（GSEA）：使用clusterProfiler 包，分別以“c5. go. bp. v7.4. entrez. gmt”“c2. cp. kegg. v7.4.entrez. gmt”為參考基因集對RA 和生物標志物進行GSEA，以P＜0.05和adjustedP＜0.05篩選顯著通路。

免疫細胞浸潤的評估：使用CiberSort算法獲取22種免疫細胞浸潤水平，比較RA 組與HC 組免疫細胞浸潤的差異；從InnateDB數據庫（https：//www.innatedb.ca/）中獲取先天免疫基因，進行相關性分析。

1.4 mRNA 表達水平檢測

采用RT-PCR 法。取對數生長期的MH7A 細胞，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的Dulbecco 改良Eagle 培養基，于37 ℃、5% CO2條件下培養，4 ℃下12 000 r/min 離心15 min，提取總RNA，并測定RNA 的濃度和純度。反轉錄得到cDNA，反應體系20 μL，循環程序：94 ℃5 min，94 ℃30 s，57 ℃30 s，40 個循環；72 ℃30 s。引物序列：CKAP2為5'-AGGCTGTTACAACATAAGAG - 3'和5'- GAAACTGACAAGGTACGATTAG - 3'；GAPDH為5' - CACCCACTCCTCCACCTTTG-3'和5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG -3'。以GAPDH 為內參，通過2-ΔΔCT分析mRNA 的相對表達水平。所有樣品重復3次。

1.5 蛋白表達水平檢測

采用Western blot 法。收集MH7A 細胞，裂解得上清液，使用BCA 試劑盒測定蛋白質濃度。將20 μL 上清液與5 × loading buffer 混合，98 ℃煮沸，12 000 r / min離心1 min，12% SDS - PAGE 凝膠電泳，轉移至PVDF膜，5%脫脂乳（以含吐溫-20的Tris緩沖鹽溶液為溶劑）封閉1 h，4 ℃兔抗CKAP2多克隆抗體（1∶1 000，V/V）孵育過夜，二抗孵育2 h，檢測。

1.6 相關中藥預測

從TCMSP 數據庫（https：// tcmspw. com/）中獲取所有中藥的活性成分及其對應基因，將其與DEGs的重疊基因作為中藥治療RA的靶基因，統計中藥對應的靶基因數量。篩選類藥性（DL）＞0.18的活性成分，以及靶基因數量大于上四分位數的中藥，利用Cytoscape 3.7.1 構建中藥-活性成分-靶基因網絡圖，使用MCODE 插件篩選評分最高的模塊，其包含的中藥可能是用于治療RA的中藥。

1.7 數據分析

采用GraphPad Prism 5.0 軟件進行統計學分析。計量資料以X±s表示，行t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異表達基因分析

共有706個差異表達基因，其中包括上調基因410個，下調基因296個。詳見圖1（火山圖中，紅色表示上調，藍色表示下調，灰色表示不顯著）。

A. 主成分分析聚類圖 B. 差異表達基因火山圖 C. 顯著差異表達基因熱圖圖1 差異表達基因分析A.Cluster diagram of principal component analysis B.Volcano plot of differentially - expressed genes C.Heatmap of significantly differentially -expressed genesFig.1 Analysis of differentially - expressed genes

2.2 GSEA

基因本體論（GO）功能富集中的生物過程（BP）分析顯示，RA主要富集在B淋巴細胞受體信號通路、抗原受體介導的信號通路、免疫反應調節細胞表面受體信號通路、免疫球蛋白的產生等生物學途徑；京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析顯示，RA 主要富集在原發性免疫缺陷、免疫球蛋白A（IgA）產生的腸道免疫網絡、抗原加工和呈遞、自身免疫性甲狀腺疾病等信號通路。詳見圖2。

A，C. 生物學過程 B，D.KEGG通路圖2 基因集富集分析A，C.Biological processes B，D.KEGG pathwaysFig.2 Analysis of gene set enrichment

2.3 WGCNA

共得到5 個模塊。模塊與臨床癥狀相關性分析顯示，綠松石（顏色）模塊中的基因不僅與模塊相關度高，而且與RA也高度相關（r=0.87，P＜0.001）。詳見圖3。

A. 不同軟閾值下的擬合優度 B. 模塊與RA相關性熱圖 C. 聚類分析樹狀圖 D. 綠松石模塊特征散點圖圖3 加權基因共表達網絡分析A.Goodness of fit under different soft thresholds B.Heatmap of correlation between module and RA C.Tree diagram of cluster analysis D.Characteristic scatter diagram of turquoise moduleFig.3 Analysis of weighted gene co - expression network

2.4 核心基因與潛在生物標志物的篩選與驗證

獲得32 個核心基因。通過2 種算法篩選得到重疊基因CKAP2（見圖4）。使用受試者操作特征（ROC）曲線檢驗CKAP2的診斷效能。訓練集中CKAP2的藥- 時曲線下面積（AUC）為0.994，測試集中為0.963。與HC 組比較，RA 組患者CKAP2表達水平顯著上調（見圖5）。外部驗證其AUC分別為0.933 和0.866，表明CKAP2具有較高的診斷價值。BP 的GSEA 分析顯示，CKAP2主要富集于T 淋巴細胞選擇、B 淋巴細胞受體信號通路、肽抗原的抗原加工和呈遞等生物途徑；KEGG 的GSEA 分析顯示，CKAP2主要富集于同種異體排斥、原發性免疫缺陷、IgA 產生的腸道免疫網絡、抗原加工和呈遞、系統性紅斑狼瘡和細胞黏附分子（CAM）等信號通路。

2.5 免疫浸潤分析

與HC 組比較，RA 組患者M1 巨噬細胞、漿細胞、活化的記憶T淋巴細胞CD4+、T淋巴細胞CD8+、濾泡輔助T 淋巴細胞等浸潤較多，而在靜息的樹狀細胞、活化的自然殺傷（NK）細胞、活化的肥大細胞、靜息的記憶T 淋巴細胞CD4+等浸潤較少。詳見圖6。CKAP2表達量與免疫細胞相關性分析顯示，CKAP2的表達與漿細胞、T 淋巴細胞CD8+呈顯著正相關（r= 0.84，P= 5.0 × 10-15；r= 0.70，P= 4.1 × 10-9），與靜息的記憶T 淋巴細胞CD4+、活化的肥大細胞呈顯著負相關（r= - 0.69，P=1.5×10-8；r=-0.56，P=1.2×10-5）。詳見圖7。

從InnateDB數據庫獲取先天免疫基因，分析CKAP2與先天免疫基因的相關性。結果顯示，CKAP2的表達與CD27，PLCG2，UCP2呈顯著正相關，與IL1R1，EGFR，PARD3呈顯著負相關（P＜0.05）。其中，CKAP2與CD27表達的相關性最高（r=0.92，P＜0.001）。

2.6 CKAP2 體外表達水平的驗證

與不含白細胞介素1β（IL - 1β）的MH7A 細胞比較，含IL-1β的MH7A 細胞中CKAP2的mRNA、蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。詳見圖8。與前述分析結果一致，表明數據分析中鑒定出的RA 潛在生物標志物CKAP2在MH7A細胞中變化顯著。

2.7 相關中藥預測

共篩選出108種中藥，構建中藥-活性成分-靶基因網絡圖，使用MCODE插件篩選高得分模塊后得到11種中藥（包括蒼耳子、黃芩、黨參等）。詳見圖9。

A. 中藥篩選 B. 中藥- 活性成分- 靶基因網絡 C.MCODE得分最高的模塊圖9 中藥預測A.Screening of TCMs B.Network of TCMs - active components - targets C.Modules with the highest score of MCODEFig.9 Prediction of TCMs

3 討論

RA 病因復雜，由于關節破壞的不可逆性，早期診斷對于預防RA 進展有重要作用。目前已有的生物標志物不能滿足臨床需求，仍有部分RA患者漏診［10］，因此，尋找新的、更有效的生物標志物，分析RA 免疫細胞浸潤情況，預測RA 新的治療藥物，對于RA 患者的診斷與治療具有重要意義。

本研究中發現，CKAP2 可能為RA 的潛在生物標志物，且篩選出的CKAP2在內外部驗證中均可靠，表明本研究的整合策略是可行的。CKAP2 為微管結合蛋白，具有穩定微管的作用，可調節非整倍體、細胞周期和細胞凋亡［11］。既往研究表明，CKAP2 在乳腺癌［12］、卵巢癌［13］、胃癌［14］及其他惡性腫瘤［15］中可通過各種機制縮短患者的總生存期。然而，其在RA中的表達水平與作用尚無研究報道。有文獻報道，肝癌細胞中CKAP2基因沉默顯著降低了其細胞內JAK2 和STAT3 的磷酸化水平，抑制了JAK/STAT 信號通路的激活［16］。動物實驗表明，磷酸化JAK2 和STAT3 的表達與RA 模型大鼠損傷程度高度相關［17］。此外，RA中JAK/STAT信號通路持續激活可導致基質金屬蛋白酶（MMP）基因表達水平升高，而MMP 可降解關節細胞外基質成分，導致關節軟骨病變［18］。且激活JAK/STAT信號通路可阻礙成纖維樣滑膜細胞（FLS）生長而促進其凋亡，導致滑膜細胞增生［19］。

本研究中發現，CKAP2在RA 患者中的表達上調，推測其可能參與了RA 的病理過程。GSEA 分析顯示，RA 的發生及CKAP2高表達主要與T 淋巴細胞、樹狀細胞遷移與趨化、B淋巴細胞、抗原加工、CAM及腸道分泌型IgA 免疫作用有關。既往研究表明，樹突狀細胞、B 淋巴細胞可介導T 淋巴細胞活化，活化的T 淋巴細胞分泌促炎細胞因子引起滑膜炎癥，導致關節病理性損傷，促進RA 疾病的進展［20］。CAM 在RA 的發病中起關鍵作用，其隨白細胞浸潤到滑膜室中，滑膜微血管中的內皮細胞激活，CAM表達量增加［21］。這些研究結果進一步表明CKAP2 與RA 進展有關，且可能作為其潛在的生物標志物。

通過分析CKAP2與免疫細胞和先天免疫基因的相關性，發現CKAP2的表達與漿細胞、T 淋巴細胞CD8+和CD27呈顯著正相關，而與靜息記憶T 淋巴細胞CD4+、活化的肥大細胞呈顯著負相關。既往研究表明，漿細胞、T 淋巴細胞、肥大細胞和自然殺傷細胞在RA 中起重要作用［20，22］。此外，CD27已被證明可防止T 淋巴細胞凋亡，并在RA 的發生和發展中發揮重要作用［23］。本研究結果表明，CKAP2 與CD27呈強相關，因此推測CKAP2通過上調漿細胞、T 淋巴細胞CD8+、CD27或下調靜息的記憶T 淋巴細胞CD4+、活化的肥大細胞來參與RA 的發生、發展。并驗證了CKAP2 在MH7A 細胞中的mRNA 和蛋白表達水平與生物信息學分析結果一致，進一步證明了本次分析的可靠性和CKAP2對RA發展的重要性。此外，為尋找治療RA 的潛在中藥，本研究中利用TCMSP 數據庫獲得了DEGs 相關的中藥11 種。這些中藥未來均可能被開發為治療RA的新藥。

但本研究也存在一定不足，如初步篩選的所有數據均來源于公共數據庫，屬回溯性研究，缺乏對其在RA中的作用及其他基因間詳細關系的具體研究。

綜上所述，CKAP2 可作為RA 早期診斷的候選生物標志物，蒼耳子、黃芩、黨參等11 種中藥對RA 具有潛在治療作用。本研究可為治療RA 中藥的研發提供新思路。