吸入用乙酰半胱氨酸溶液自研藥非臨床安全性評價*

劉靜歡，孫立杰，楊 嫻△

（1. 石家莊四藥有限公司，河北石家莊 050000； 2. 河北醫科大學藥學院，河北石家莊 050000；3. 河北省大容量注射劑工程技術研究中心，河北石家莊 050000）

乙酰半胱氨酸來源于蔥屬植物，為L-半胱氨酸和抗氧化劑谷胱甘肽的前體，具有抗氧化、抗炎和黏液溶解作用，其常見劑型有顆粒劑、片劑、泡騰片、膠囊、霧化吸入劑等［1-3］。霧化吸入給藥劑量低、起效快，能直接作用于氣道，以達到較高的局部藥物濃度，已廣泛用于呼吸道疾病的治療［4］。吸入用乙酰半胱氨酸溶液［原研藥為Zambon SpA 公司的Fluimucil（富露施）］，臨床主要用于治療濃稠黏液分泌物過多的呼吸道系統疾病?！端幤纷怨芾磙k法》要求，申請藥品注冊時應提供臨床前安全性等相關資料［5］，安全性實驗是藥物研發過程中的基礎工作，其中對于霧化吸入給藥，呼吸道刺激性和主動全身過敏反應為較可能出現的安全問題［6］。因此，本研究中依據《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》《藥物非臨床研究質量管理規范》和吸入用乙酰半胱氨酸溶液臨床擬訂用法用量，通過開展日本大耳白兔呼吸道刺激性實驗和豚鼠主動全身過敏實驗，對吸入用乙酰半胱氨酸溶液自研藥進行非臨床安全性評價研究?，F報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

NE - C28 型壓縮式吸入器（日本Omron 公司）；BSA5201 - CW 型電子天平（德國Sartorius 公司，精度為0.1 g）；ASP300S型全自動組織脫水機、HI210型攤片機、HI1220型烘干機、ST5020型多功能染色機、DM3000型生物顯微鏡、病理圖像分析系統（含DFC450 型攝像頭+ Leica Application Suite V4 圖像采集軟件），均購自德國Leica公司。

1.2 試藥

吸入用乙酰半胱氨酸溶液（自研藥，某公司，批號為16052231，含量為100.8%；原研藥，批號為28 003128；規格均為3 mL∶0.3 g）；0.9%氯化鈉注射液（山東齊都藥業有限公司，批號為2A15032901，規格為每袋100 mL∶0.9 g）；10%卵白蛋白溶液（美國Sigma 公司，批號為SLBL1882V，規格為每瓶250 g，臨用前加入適量氯化鈉注射液充分溶解并定容）；10%中性福爾馬林溶液（中國Biosharp 公司，批號為BL388A）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號為G1120）。

1.3 動物

普通級日本大耳白兔20只，雄性，檢疫結束剔除2只，用于實驗前霧化速率測定；普通級Hartley豚鼠36只，雌雄各半，其中6 只用于檢疫剔除；均購于北京市昌揚西山養殖場，實驗動物生產許可證號分別為SCXK（京）2011 - 0010，SCXK（京）2016 - 0007，動物質量合格證編號分別為11402300002572，11402300002573。本實驗所用動物及相關處置均符合動物福利標準。

2 方法與結果

2.1 供試品粒徑分析

檢測樣品粒徑分布，需符合供霧化器用的液體制劑要求。

2.2 呼吸道刺激實驗［7-10］

2.2.1 方法

劑量設計依據：吸入用乙酰半胱氨酸溶液成人和兒童不區分劑量，臨床擬用最大量計算，即為10 mg/kg，日本大耳白兔折算系數為3.1［11］，故等效劑量為31 mg/kg，本次實驗家兔一次給藥量按35 mg/kg計算。

分組及給藥：取18 只兔，給藥前稱定體質量，據此按分層隨機化分組法分為陰性對照組（等體積0.9%氯化鈉注射液）、上市品對照組（原研藥0.1 mg/mL）和給藥組（自研藥0.1 mg/mL），各6 只，依次編為1-18 號，各組霧化吸入給予相應藥物（35 mg/kg，0.35 mL/kg），每日上下午各1次，連續14 d。

觀察指標：給藥前后觀察兔的外觀、行為、糞便等，每天觀察呼吸道刺激性4次，并記錄癥狀（如咳嗽）發生及恢復時間。分別于末次給藥24 h 及14 d 后，以2%戊巴比妥鈉（30～40 mg/ kg）靜脈注射麻醉，每組取3 只兔，以股動脈放血的方法處死，解剖，肉眼觀察動物口腔（唇、上顎、舌），鼻，咽，喉，氣管，支氣管，肺有無充血、紅腫等刺激性反應。取上述組織器官，經常規脫水，石蠟包埋，切3～5 μm 厚片，HE 染色，顯微鏡下檢查病理形態。

2.2.2 結果

實驗期間，各組兔外觀、行為、糞便等均正常，給藥后無咳嗽等癥狀。大體解剖后，除給藥組中1 只兔氣管內見少量紅色液體外，其余兔的呼吸系統均未見明顯異常。末次給藥結束和恢復期結束后的病理學檢查中，3 組兔均出現刺激反應。與陰性對照組和上市品對照組比較，給藥組未見藥物延遲或蓄積作用。詳見表1、圖1。

圖1 末次給藥24 h后實驗兔肺及氣管的病理形態（HE，×10）Fig.1 Pathological morphology of lungs and trachea in rabbits after 24 h of the last administration（HE，×10）

表1 呼吸道刺激性試驗組織病理學檢查結果Tab.1 Results of histopathological examination in the respiratory irritation test

2.3 主動全身過敏實驗［7-8，12-13］

2.3.1 方法

劑量設計依據：乙酰半胱氨酸溶液臨床使用劑量約為10 mg/kg，每日2次，豚鼠折算系數為4.6［11］，則豚鼠等效劑量為92 mg/kg，豚鼠的平均體質量按400 g計算，每只豚鼠給藥劑量約為36.8 mg。

分組及給藥：取30 只豚鼠，檢疫期最后1 天稱定豚鼠體質量，據此按分層隨機化分組法分為陰性對照組（0.9%氯化鈉注射液0.8 mL/d），陽性對照組（0.9%氯化鈉注射液0.8 mL/d），上市品對照組［原研藥80 mg/d（0.8 mL/d）］，以及低劑量組［自研藥40 mg/d（0.4 mL/d）］和高劑量組［自研藥80 mg/d（0.8 mL/d）］，各6 只，雌雄各半。各組隔日致敏給藥（10%卵白蛋白溶液0.6 mL/d）1 次，共3 次。分別于末次致敏14 d 和21 d 后，每組分別取3 只豚鼠，按致敏劑量的2 倍進行激發。致敏期間每日觀察豚鼠的癥狀；激發時，給藥后即刻至給藥后3 h詳細觀察豚鼠的反應、癥狀的出現及消失時間。過敏反應發生程度參照《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》全身致敏性評價標準［8］，實驗中豚鼠出現不安寧、豎毛、發抖和搔鼻為過敏反應弱陽性，噴嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、排糞和流淚為過敏反應陽性，呼吸困難、哮鳴音、紫癜、步態不穩、跳躍、喘息、痙攣、旋轉和潮式呼吸為過敏反應強陽性，死亡為過敏反應極強陽性。同時根據觀察結果計算過敏反應發生率，并進行綜合評價。

2.3.2 結果

實驗期間，各組豚鼠飲水、攝食及行為活動正常，健康狀況良好，未出現與給藥相關的異常癥狀。低、高劑量組，上市品對照組及陰性對照組豚鼠激發后即刻至觀察結束均未見過敏反應癥狀，過敏反應均為陰性。僅陽性對照組豚鼠激發后出現不安寧（6/6）、咳嗽（3/6）、呼吸困難（4/ 6）、痙攣（6/ 6）、潮式呼吸（6/ 6）等不同程度的過敏反應癥狀，并在激發后5 min 內全部死亡；過敏反應均呈極強陽性（6/ 6）。表明豚鼠霧化吸入吸入用乙酰半胱氨酸溶液自研藥未發生全身主動過敏反應。

3 討論

制劑的原料和輔料及制備、貯存過程中產生的雜質均可能引發藥物毒性作用，進而影響制劑的安全性［8］。吸入制劑在非臨床研究階段，以經口鼻吸入給藥與臨床擬用途徑最接近［14］。本研究中將連有壓縮霧化器的噴霧面罩緊貼于大耳白兔與豚鼠口鼻部，開啟壓縮霧化器，進行霧化吸入給藥，最大限度地模擬吸入用乙酰半胱氨酸的給藥方式。霧化給藥劑量通過給藥時間控制，使用分組后的剩余動物模擬實際給藥過程，以測定霧化速率，根據霧化時間和溶液消耗體積計算出溶液霧化器平均噴霧速率，并據此計算霧化吸入給藥時間。其中，供試品的給藥劑量均根據臨床使用劑量與不同動物間的折算系數進行設計，且吸入劑量均高于臨床擬用最大劑量，可充分暴露藥物在使用中可能產生的局部和全身毒性。

吸入用乙酰半胱氨酸溶液對鼻咽和胃腸道有一定刺激作用。據報道，患者吸入富露施后出現胸悶、氣短癥狀［15］。本研究的主動全身過敏實驗中，低、高劑量組及上市品對照組豚鼠無任何呼吸困難、痙攣等過敏反應癥狀。在呼吸道刺激性實驗中，給藥結束期的陰性對照組、給藥組與上市品對照組大部分實驗兔出現鼻黏膜炎細胞浸潤、鼻腔炎性分泌物、咽喉表面炎性分泌物等輕微呼吸道刺激反應，且病變程度無明顯差異。另外，部分動物咽喉表面可見少量炎性分泌物，9 號兔（歸屬給藥結束時的上市品對照組）的氣管、支氣管黏膜固有層血管輕度擴張充血，其余組織未見明顯組織病理學改變。呼吸道刺激性實驗恢復期結束，陰性對照組、上市品對照組和給藥組實驗兔仍可見鼻腔炎性分泌物、鼻黏膜炎細胞浸潤，但給藥組家兔鼻黏膜炎細胞浸潤、鼻腔炎性分泌物有一定程度的增加。另外，18 號兔（歸屬恢復期結束時的給藥組）的氣管、支氣管黏膜有輕度炎細胞浸潤，肺臟有輕微炎細胞浸潤。綜合已有家兔呼吸道組織病理學背景資料，考慮該組織病理學改變主要和動物自身的健康狀態有關。肺泡壁骨化生散在分布于陰性對照組、上市品對照組和給藥組家兔，且程度不做分級處理，為家兔的背景性病變。

綜上所述，乙酰半胱氨酸溶液自研藥對日本大耳白兔無明顯呼吸道刺激作用，對豚鼠無明顯的全身致敏作用。