氟維司群注射液前處理及細菌內毒素檢查方法研究*

洪 穎，翁鷺娜，林麗花，蓋雅婷

（福建省廈門市食品藥品質量檢驗研究院，福建廈門 361000）

乳腺癌為女性最常見的惡性腫瘤，68%～78%的患者表達雌激素受體（ER）和/ 或孕激素受體（PR）［1］。氟維司群屬雌激素受體拮抗劑［2］，其通過直接與ER 結合來抵消雌激素的作用［3］，對Luminal 亞型的療效確切，可直接用于導管內注射，給藥頻率相對較低，從而提高了患者的治療依從性［4］。鱟試劑與內毒素的反應多在水中進行，氟維司群為油注射液，在水中不溶，不宜直接作為樣品進行細菌內毒素檢查。鑒于氟維司群注射液尚未被各國藥典收載，本研究中采用加水萃取的前處理方法，考察水相干擾試驗、加水萃取過程中油溶液的內毒素回收比，采用凝膠法、動態顯色法、動態濁度法等檢查細菌內毒素，為該產品的細菌內毒素檢查提供參考?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BET-48G 型細菌內毒素測定儀（天津天大天發科技有限公司）；Research plus 型微量移液器（德國Eppendorf公司，移液范圍50～1 000 μL）；M3 basic 型渦旋混合器（德國IKA公司）；3-15 Operating Manual型高速離心機（美國Sigma公司）。

1.2 試藥

氟維司群注射液（某公司，共3 批，批號分別以A，B，C 指代，規格為每支5 mL∶250 mg）；細菌內毒素工作標準品（CSE，湛江安度斯生物有限公司，批號為2205050，規格為每支10 EU）；鱟試劑1，2（TAL1，TAL2，湛江安度斯生物有限公司，批號分別為2203160，2202230，靈敏度分別為0.125 EU/ mL 和0.005～50 EU/ mL）；鱟試劑3（TAL3，福州新北生化工業有限公司，批號為21101012，靈敏度為0.125 EU/ mL）；鱟試劑4（TAL4，廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，批號為22034102，靈敏度為0.005～10 EU/ mL）；細菌內毒素檢查用水（BET用水，湛江安度斯生物有限公司、福州新北生化工業有限公司，批號分別為2105260，21070105，規格均為每支5 mL）。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值（L）的確定

計算公式為L=K/M。其中，K為人每千克體質量每小時最大可接受內毒素劑量，M為人用每千克體質量每小時的最大供試品劑量。根據藥品說明書，本品的每日最大劑量為500 mg，按第43 版美國藥典（2020 年），M= 500 mg / 1.8 m2= 277.78 mg / m2，L=K/M=100（EU·m2）/ 277.78（mg/ m2）= 0.36 EU/ mg；按2020 年版《中國藥典（四部）》通則1143（以下簡稱通則1143）［5］，K= 5 EU/（kg·h），體質量按60 kg 計算，注射時間＜1 h（按1 h計），計算得M=8.33 mg/（kg·h），L=0.60 EU/mg。從嚴要求，將L定為0.36 EU/mg。

測定樣品中的內毒素，需將其與水充分渦旋混勻后，測定水相中內毒素的含量。水萃取條件：取氟維司群注射液0.5 mL，加BET 用水5 mL，2 000 r/ min 振蕩5 min，3 000 r/min 離心5 min，取上層水相溶液進行檢測。水相溶液的內毒素限值（Lc）與氟維司群注射液的內毒素限值（L）存在以下關系：Lc水×V水=L油×V油×內毒素回收比（%），假設回收比為100%，則Lc水=L油×V油/V水=1.8 EU/mL。

2.2 凝膠法試驗

2.2.1 靈敏度復核

依據通則1143 對所用鱟試劑進行復核，結果TAL1與TAL3的靈敏度（λc）分別為λ和1.68λ，在0.5λ～2λ范圍內，符合規定。

2.2.2 水相干擾試驗

干擾試驗預試驗：內毒素檢查時的最大有效稀釋倍數（MVD）=cL/λ，c為供試品溶液體積分數（1.0 mL/mL），λ為市售鱟試劑的標示靈敏度（通常為0.03～0.5EU/mL），則水相對應的MVD為3.6，7.2，14.4，28.8，57.6 倍。取3 批樣品，按2.1 項下方法水萃取后用BET 用水稀釋至2，4，8，16 倍系列溶液，記為供試品陰性對照（NPC）。同時制備相同稀釋倍數含0.25 EU/mL內毒素系列溶液，記為供試品陽性對照（PPC）。取TAL1 與TAL3，分別與上述NPC 和PPC 系列溶液反應，每一濃度平行2 支，同時做陽性對照（PC）和陰性對照（NC）。結果顯示，水相稀釋至2倍及以上對鱟試劑無干擾，可以該濃度進行正式干擾試驗。詳見表1（+為陽性反應，-為陰性反應；表2同）。

表1 氟維司群凝膠法水相干擾預試驗結果Tab.1 Results of interference pre - test of aqueous phase for fulvestrant by gel - clot method

表2 氟維司群凝膠法水相干擾正式試驗結果Tab.2 Results of interference test of aqueous phase for fulvestrant by gel - clot method

正式干擾試驗：取3 批樣品0.5 mL，按2.1 項下方法水萃取后，取水相，用BET用水倍比稀釋至2倍，加入CSE，制備含0.25，0.125，0.06，0.03 EU/mL 內毒素的供試品溶液，每一濃度平行4 支，同時做內毒素標準品系列溶液和NC，每一濃度平行做2 支。結果見表2?？梢?，水相稀釋至2倍對鱟試劑無干擾，即水相可稀釋至2倍進行內毒素檢查。

2.2.3 油相中內毒素回收比試驗

取CSE 3 支，分別加入3 批樣品各0.5 mL，渦旋混勻，按2.1 項下方法水萃取得水相，加BET 用水稀釋得8 倍、16 倍、32 倍、64 倍系列濃度，進行內毒素含量檢測，每一濃度平行4 支。加入CSE 的樣品溶液濃度為20 EU/mL，萃取入水相后水相中內毒素含量為2 EU/mL，即16λ。取CSE 1支，加BET用水配制至2 EU/mL，再進行8 倍（0.25 EU/ mL）、16 倍（0.125 EU/ mL）、32 倍（0.06 EU/mL）和64 倍（0.03 EU/mL）系列稀釋，每一濃度平行2 支，另做NC。結果表明，標準品溶液系列結果符合鱟試劑靈敏度復核試驗要求，各批次水相8 倍稀釋（理論值0.25 EU/mL）下與鱟試劑反應均為陽性，64 倍稀釋（理論值0.03 EU/mL）下與鱟試劑反應均為陰性，內毒素回收比范圍在50%～200%，符合要求。詳見表3。

表3 氟維司群凝膠法油相中內毒素回收比試驗結果Tab.3 Results of endotoxin recovery - ratio test in oily phase for fulvestrant by gel - clot method

2.2.4 凝膠限度試驗

按通則1143 用TAL1 對3 批樣品進行細菌內毒素檢查，按2.1 項下方法水萃取后，取水相加BET 用水稀釋2 倍后進行檢查，NPC 結果均為陰性，PPC 結果均為陽性，結果表明3 批樣品細菌內毒素檢驗結果均符合規定。

2.3 動態顯色法試驗

2.3.1 標準曲線可靠性試驗

按通則1143，制備濃度分別為2.0，0.5，0.125，0.031 25 EU/ mL 的內毒素標準品溶液，各取0.1 mL，分別加入預先添加0.1 mL 鱟試劑（TAL2）的試管中，混勻，檢測，每個濃度平行3 支，另做2 支NC。工作波長405 nm，預設吸光度0.05，結果見表4。以反應時間（t）的對數（lg）值為橫坐標、溶液中內毒素濃度（C）的lg 值為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程lgt1=2.493 55-0.389 09 lgC1（r= - 1.000）。|r| ＞0.98，NC 反應時間大于標準曲線最低點的反應時間，表明標準曲線可靠性試驗有效。

表4 動態顯色法標準曲線可靠性試驗結果（n=3）Tab.4 Results of reliability test of standard curve by kinetic chromogenic assay（n = 3）

2.3.2 水相干擾試驗

取3 批樣品，按2.1 項下方法水萃取，水相用BET用水稀釋至2倍、4倍、8倍、16倍系列溶液，記為a液，同時制備同樣稀釋倍數的含0.5 EU/mL內毒素的系列溶液，記為b液，進行回收試驗，分別取上述溶液各0.1 mL，加入預先添加0.1 mL鱟試劑的試管內中，混勻，每個濃度平行2支，同時做標準內毒素溶液管和NC管。測定結束后，按標準曲線回歸方程分別計算a 液和b 液的細菌內毒素含量，回收比按公式回收比=（Cb液-Ca液）/0.5×100%計算。結果見表5（其中a 液各溶液結果均小于檢測限，但儀器仍會有實測值，并根據實測值計算回收比）。表明各批次水相溶液的各稀釋倍數回收比均在50%～200%范圍內，即水相在稀釋至2 倍及以上時對鱟試劑無干擾。

表5 動態顯色法水相干擾試驗結果（n=2）Tab.5 Results of interference test of aqueous phase by kinetic chromogenic assay（n = 2）

2.3.3 油相中內毒素回收比試驗

預添加CSE 的樣品制備同2.2.3 項下方法，按前法進行水萃取。取水相，加BET 用水稀釋至8 倍、16 倍、32 倍、64 倍系列濃度，進行內毒素含量檢測，每個濃度平行2 支。水相中內毒素含量理論值為2 EU/mL，原液內毒素含量= 實測值× 稀釋倍數，絕對回收比= 原液內毒素含量/（2 EU/mL）×100%。結果見表6?？梢?，樣品外加內毒素20 EU/mL經振蕩萃取后，用顯色法檢測內毒素回收比在65.04%～98.02%范圍內，均符合要求（在50%～200%范圍內）。隨著稀釋倍數的增大，絕對回收比有下降趨勢。

表6 動態顯色法油相中內毒素回收比試驗結果（n=2）Tab.6 Results of endotoxin recovery - ratio test in oily phase by kinetic chromogenic assay（n = 2）

2.4 動態濁度法試驗

2.4.1 標準曲線可靠性試驗

按2.3.1 項下方法制備系列濃度的內毒素標準品溶液，各取0.1 mL，分別加入預先添加0.1 mL 鱟試劑（TAL4）的試管中，混勻，檢測，每個濃度平行3 支，另做2支NC。工作條件同2.3.1項，結果見表7。以lgt為橫坐標、lgC為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程lgt2=2.501 16 - 0.373 4 lgC2（r= - 0.997），表明標準曲線可靠性試驗有效。

表7 動態濁度法標準曲線可靠性試驗結果（n=3）Tab.7 Results of reliability test of standard curve by kinetic turbidimetric assay（n = 3）

2.4.2 水相干擾試驗

試驗方法同2.3.2 項下，結果見表8?？梢?，各批次水相溶液的各稀釋倍數回收比均在50%～200%范圍內，表明水相稀釋至2倍及以上時對鱟試劑無干擾。

表8 動態濁度法水相干擾試驗結果（n=2）Tab.8 Results of interference test of aqueous phase by kinetic turbidimetric assay（n = 2）

2.4.3 油相中內毒素回收比試驗

試驗方法同2.3.3 項下，結果見表9?？梢?，樣品外加內毒素20 EU/mL經振蕩萃取后，用動態濁度法檢測內毒素絕對回收比在62.52%～113.64%范圍內，均符合要求（在50%～200%范圍內）。

表9 動態濁度法油相中內毒素回收比試驗結果（n=2）Tab.9 Results of endotoxin recovery - ratio test in oily phase by kinetic turbidimetric assay（n = 2）

3 討論

細菌內毒素與鱟試劑的系列酶促反應需在水中進行［6］，如待測樣品水溶性差，則需進行前處理后再進行檢測［7-9］。氟維司群注射劑為油注射劑，如直接用水稀釋進行后續反應，存在稀釋濃度不準確、內毒素被油包裹釋放不完全等問題，很可能導致檢測結果不準確。因此，找到該類制劑合適的前處理方法是進行細菌內毒素檢查的必要前提。前期探索研究時曾參考原料藥的處理方法［10］，采用二甲基亞砜、甲醇等有機溶劑溶解注射液后，再用BET 用水稀釋進行檢查，但出現溶劑對鱟試劑有干擾、內毒素絕對回收比無法達到要求等問題。

對于油溶液，萃取亦是常用的前處理方法，由于內毒素溶于水，首先考慮用水作為溶劑進行萃取，在進行干擾試驗時，應考慮以下兩點。一是萃取后的水相可見些許渾濁，提示油相中有部分輔料和藥物可能溶解于水中，應驗證水相溶液對鱟試劑與內毒素的凝集反應是否有干擾作用［11-12］。二是對于需前處理的樣品，為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內毒素失去活性，要考察萃取后油液中內毒素的絕對回收比［13］，即要使用預先添加了標準內毒素再經過處理的供試品溶液進行干擾試驗或檢測，絕對回收比應在50%～200%范圍內。

凝膠法為我國目前內毒素檢測的“仲裁法”，檢驗操作簡單，在日常檢驗中采用較多，但凝膠法僅可定性檢測內毒素含量是否超過限值，無法準確定量。動態光度測定法能得到較確切的數值，在檢驗、生產質量控制中應用較廣泛［14］。本研究中分別采用凝膠法、動態顯色法、動態濁度法等對萃取后的水相溶液進行干擾試驗，確認水相溶液稀釋至2倍及以上時，在各方法下對鱟試劑反應均無干擾，且油液中內毒素絕對回收比滿足要求。表明本研究采用的前處理方法操作簡便、水相干擾小，適用于目前常用的3種細菌內毒素檢查方法，能較準確地檢測氟維司群注射液中內毒素的含量。

綜上所述，氟維司群注射液采用凝膠法、動態顯色法、動態濁度法進行細菌內毒素檢查均可行，擬訂的檢查方法為取樣品0.5 mL，加入BET用水5 mL，2 000 r/min振蕩5 min，3 000 r/min離心5 min，取水相，按2020年版《中國藥典（四部）》通則1143 檢查，每1 mg 氟維司群中內毒素含量應小于0.36 EU。