龍澤熊膽膠囊質量標準提升研究*

蘇章軒，劉瀟瀟，張愷東，陸 佳

（廣東省藥品檢驗所，廣東廣州 510180）

龍澤熊膽膠囊由龍膽、黃連、黃芩、防風等17 味中藥材組成，有清熱散風、止痛退翳功效，臨床用于治療風熱或肝經濕熱引起的目赤腫痛、羞明多淚［1］。龍澤熊膽膠囊現行標準收載于2020 年版《中國藥典（一部）》，其中鑒別項目以當歸、梔子、防風、黃連為對照藥材，阿魏酸、梔子苷、鹽酸小檗堿、熊去氧膽酸為對照品進行薄層色譜（TLC）鑒別，但在檢驗中發現，防風的TLC 鑒別方法存在色譜拖尾嚴重、專屬性不強等問題，嚴重影響對樣品結果的判定。而在含量測定項中，現行標準僅對龍膽苦苷的含量進行測定，指標偏少。鑒于防風質量控制方法專屬性不強，且藥材來源較混亂的現狀［2-5］，存在部分企業誤投少投的可能，本研究中對防風特征性成分升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇進行TLC鑒別及含量測定［6-10］，為進一步完善和優化制劑的質量標準提供參考?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 20AT 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司），含SPD-M20A型二極管陣列檢測器；KQ-300DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CP224S 型和CP225D 型電子天平（德國Sartorius 公司，精度均為0.01 mg）。

1.2 試藥

龍澤熊膽膠囊（20 批，廣東省藥品檢驗所抽檢樣品，來自11個生產廠家，樣品信息見表1，其中，樣品1-9分別來自廠家a-I，樣品10-20均來自廠家k）；防風對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號為120947 -201810）；升麻素對照品（批號為AF21092804，含量98.0%），5 -O- 甲基維斯阿米醇對照品（批號為AF20100511，含量98.0%），均購于成都埃法生物科技有限公司；預制硅膠G 薄層板（德國Merck 公司，青島海洋化工廠分廠）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

2.1.1 方法建立

稱取樣品內容物2.5 g，加乙醇50 mL，加熱回流30 min，冷卻至室溫，濾過，濾液蒸干，殘渣加氨試液10 mL 使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3 次（20，20，10 mL），合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水20 mL洗滌，取正丁醇液蒸干，殘渣加乙醇4 mL 使溶解，加在中性氧化鋁柱上（100～200目，3 g，內徑為1.0～1.5 cm），用乙醇100 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇10 mL 使溶解，即得供試品溶液；取升麻素、5 -O- 甲基維斯阿米醇對照品各適量，加甲醇制成每1 mL 各含1 mg的單一對照品溶液；取防風對照藥材0.5 g，加甲醇20 mL，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）處理20 min，濾過，蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，即得對照藥材溶液；按龍澤熊膽膠囊處方及工藝制備缺防風的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。將硅膠G薄層板于105 ℃活化20 min，吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯- 乙酸乙酯- 丙酮（2∶4∶3，V/V/V）為展開劑，預飽和20 min，取出，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱1 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜和對照藥材溶液色譜相應位置均顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。

2.1.2 耐用性考察

展開溫度：取上述溶液各5 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，保持相對濕度為65%，分別置4 ℃和25 ℃下展開，按擬訂展開方法操作，結果見圖1?？梢姺蛛x效果在2 種溫度下無明顯差異，表明本方法在不同溫度條件下適應性均較好。

1 - 9. 供試品溶液（樣品1 - 9） 10. 對照藥材溶液 11. 升麻素對照品溶液 12.5 - O - 甲基維斯阿米醇對照品溶液13. 陰性對照品溶液A.25 ℃ B.4 ℃圖1 展開溫度考察1 - 9.Test solution（samples 1 - 9） 10.Medicinal materials reference solution 11.Cimifugin reference solution 12.5 - O - methylvisamminol reference solution 13.Negative reference solutionA.25 ℃ B.4 ℃Fig.1 Investigation of temperature

展開濕度：取上述溶液各5 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，保持展開溫度為25 ℃，分別在相對濕度32%和88%的展開缸內展開（展開缸內提前用不同比例的硫酸- 水混合液調節相對濕度），按擬訂展開方法操作，結果見圖2。結果相對濕度為88%時比移值較小，但并未影響分離與鑒別效果。

1 - 9. 供試品溶液（樣品1 - 9） 10. 對照藥材溶液 11. 升麻素對照品溶液 12.5 - O - 甲基維斯阿米醇對照品溶液13. 陰性對照品溶液A.32% B.88%圖2 展開濕度考察1 - 9.Test solution（samples 1 - 9） 10.Medicinal materials reference solution 11.Cimifugin reference solution 12.5 - O - methylvisamminol reference solution 13.Negative reference solutionA.32% B.88%Fig.2 Investigation of humidity

硅膠G 薄層板：取上述溶液各5 μL，保持展開溫度為25 ℃，相對濕度為65%，點于2 個廠家的硅膠G 薄層板上，按擬訂展開方法操作，結果見圖3。結果2 個廠家的硅膠G薄層板的分離效果差異不大，故本方法對薄層板的品牌無特殊要求。

1 - 9. 供試品溶液（樣品1 - 9） 10. 對照藥材溶液 11. 升麻素對照品溶液 12.5 - O - 甲基維斯阿米醇對照品溶液13. 陰性對照品溶液A. 德國Merck公司 B. 青島海洋化工廠分廠圖3 不同硅膠G薄層板考察1 - 9.Test solution（samples 1 - 9） 10.Medicinal materials reference solution 11.Cimifugin reference solution 12.5 - O - methylvisamminol reference solution 13.Negative reference solutionA.Merck Company from Germany B.Qingdao Ocean Chemical Plant BranchFig.3 Investigation of different silica gel G plates for TLC

2.1.3 鑒別

按擬訂的TLC 方法，對k 廠生產的11 批樣品進行檢測，結果未檢出防風的特征斑點，詳見圖4。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Wondasil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）- 水（B），梯度洗脫（0～25 min 時5%A →20%A，25～30 min時20%A →25%A，30～50 min時25%A →40%A，50～51 min 時40%A →90%A，51～70 min 時90%A，70～71 min 時90%A →5%A，71～85 min時5%A）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2.2 溶液制備

分別稱取升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含升麻素50 μg、5 -O- 甲基維斯阿米醇25 μg 的混合對照品溶液。按2.1.1項下方法制備供試品溶液和陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2.2 項下3 種溶液各適量，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。詳見圖5。

線性關系考察：取升麻素對照品0.0104 1 g、5-O-甲基維斯阿米醇對照品0.010 18 g，精密稱定，加甲醇制得每1 mL 分別含1 020 μg和998 μg的單一對照品貯備液，分別精密吸取2，1 mL，加甲醇制成每1 mL含升麻素102 μg、5-O-甲基維斯阿米醇50 μg的系列混合對照品貯備液，分別精密吸取0.5，1，2，5，8，10 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液。按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以待測成分進樣量（X，ng）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y1= 3 782 748.389X1+4 207.351（R2= 1.000），Y2= 3 178 861.258X2+1 202.569（R2=1.000）。結果表明，升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇進樣量分別在0.051～1.020 μg 和0.025～0.499 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限與定量限考察：取2.2.2項下混合對照品溶液適量，逐級稀釋，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，以信噪比（S/N）為3.0和10.0時待測成分的質量濃度分別為檢測限和定量限。結果升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇的檢測限均為0.1 μg/mL，定量限均為0.3 μg/mL。

精密度試驗：取“線性關系考察”項下系列混合對照品貯備液適量，按2.2.1項下色譜條件進樣測定6次，記錄峰面積。結果升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇峰面積的RSD分別為1.12%和1.20%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（編號2）適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，1，3，6，10，12，24 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定。結果升麻素和5 -O- 甲基維斯阿米醇峰面積的RSD分別為1.21%和0.96%（n= 7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（編號2）適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，平行6份，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇含量的RSD分別為0.42%和1.24%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取樣品（編號2）內容物2.5 g，精密稱定，各6 份，加入系列混合對照品貯備液1 mL（每1 mL含升麻素102 μg、5-O-甲基維斯阿米醇50 μg），按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n = 6）

2.2.4 樣品含量測定

取樣品各適量，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，平行3 次，記錄峰面積。結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（μg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of cimifugin and 5 - O -methylvisamminol in samples（μg / g，n = 3）

3 討論

龍澤熊膽膠囊現行標準中防風的TLC 鑒別方法分離效果差，并缺乏對防風的定量控制。鑒于此，本研究中優化了現行標準中防風的TLC鑒別方法［11］，并對不同展開溫度、相對濕度、硅膠G薄層板進行了考察，結果發現，本研究中建立的方法適用性較好，且均對結果無干擾。同時，針對該復方中升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇的定量分析填補了制劑中防風含量測定的空白［12-13］。

采用本研究中所建立的方法對樣品進行含量測定時，發現升麻素和5 -O- 甲基維斯阿米醇僅在廠家k樣品中未檢出，故對該廠家樣品存疑，其有效物質成分的顯著差異可能對該藥品的有效性、安全性及臨床療效有較大影響。其原因可能為：1）生產企業為降低成本未按處方投料或少投料［14］；2）防風的地方習用品及栽培品較多，如水防風［15］、陜防風、川防風等，生產企業使用其他防風摻偽投料，或生產企業藥材鑒定水平較低，存在誤買誤用情況；3）原標準TLC 圖譜存在拖尾現象，導致企業誤判。

綜上所述，本研究中所建立的方法專屬性強，耐用性、重復性好，可發現該品種防風少投料誤投料等問題，能有效控制龍澤熊膽膠囊的質量。