高效液相色譜法測定家種連翹中山柰酚含量*

周 燦，劉忍陽，柯 靜，石金敏，趙利軍△，秦瑜蓉，張玲玲

（1. 湖北醫藥學院附屬人民醫院藥學部，湖北十堰 442000； 2. 湖北醫藥學院藥學院，湖北十堰 442000；3. 湖北省十堰市鄖西縣椴樹埡藥材種植專業合作社，湖北十堰 442600）

連翹為木犀科植物連翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl 的干燥果實，秋季果實初熟尚帶綠色時采收，除去雜質，蒸熟，曬干，習稱“青翹”；果實熟透時采收，曬干，除去雜質，習稱“老翹”；有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱功效［1］177-178。連翹中目前已分離鑒定的成分主要有苯乙醇苷類、木質素類、酚酸類及其衍生物、黃酮類、萜類及揮發油類、C6-C2 天然醇及其苷類等，其中黃酮類成分包括山柰酚、槲皮素、異鼠李素、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、橙皮苷、黃芩苷等，具有抗炎、抗氧化、抗病毒等藥理作用［2］。本研究中擬建立測定家種連翹中山柰酚含量的高效液相色譜（HPLC）法，以期為進一步控制家種連翹的內在質量及開發利用其藥用價值提供參考?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀，含CMB-20A 型控制器、DGU-20A5R型在線脫氣機、進樣泵、SIL-20A型自動進樣器、CTO-20A 型柱溫箱、SPD-M20A 型紫外檢測器（日本Shimadzu 公司）；FA2004 型電子分析天平（上海天平儀器廠，精度為0.1 mg）；HH-S 型數顯恒溫水浴鍋（常州智伯瑞儀器制造有限公司）；H1650-W 型高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；GM-0.33A型隔膜真空泵（天津市津騰實驗設備有限公司）。

1.2 試藥

山柰酚對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號為wkq17032203，含量≥98%）；連翹藥材，于2022年7月16日分別采自十堰市鄖西縣三官洞林區、上津鎮的8 個行政村（包括何家井村、三官洞村、蒿坪河村、馬家坪村、祖師殿村、孫家灣村、絞腸關村、伍峪坪村，各1批，編號為S1-S8），經湖北醫藥學院中藥學教研室張曉燕教授鑒定為正品；甲醇為色譜純，鹽酸、磷酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS柱（250 mm×4.6 mm，4.6 μm）；流動相：甲醇- 0.4%磷酸水溶液（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：365 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取山柰酚對照品12.5 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成每1 mL 含0.5 mg 山柰酚的對照品溶液。取蒸鍋，加水至約10 cm 深，加熱至沸并達圓氣狀態［3］；取藥材樣品500 g，置蒸鍋內，再次達到圓氣狀態后蒸制15 min，快速移出，瀝干水分，于50 ℃烘箱干燥36 h，取出，碾壓成粉，制成藥材樣品粉末，過2號篩；取約5.0 g，各4份，精密稱定，精密加入甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）混合溶液25 mL，稱定質量，水浴回流1 h，冷卻至室溫，再次稱定質量，用甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）補足減失的質量，搖勻，離心，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：精密吸取2.2 項下2 種溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置有吸收峰。理論板數按山柰酚峰計不低于3 000，分離度大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

1. 山柰酚A. 對照品溶液 B. 供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.KaempferolA.Reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密量取2.2項下對照品溶液0.2，1，2，4，6，8，10 mL，置10 mL 棕色容量瓶中，加甲醇定容，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y= 5 355.5X+ 5 380.3（R2= 0.999 9，n= 7）。結果表明，山柰酚質量濃度在0.01～0.5 mg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取供試品溶液（編號S5）適量，按2.1項下色譜條件連續進樣定6次，記錄峰面積。結果的RSD為0.41%（n=6），表明方法精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液（編號S8），分別于室溫下放置2，4，6，8，10，12 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為2.54%（n= 6），表明供試品溶液室溫下放置12 h內較穩定。

重復性試驗：取同一批樣品（編號S8）6份，各5.0 g，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果的RSD為4.32%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的同一批樣品（編號S8）6 份，各5.0 g，精密稱定，分別精密加入山柰酚對照品1.4 g，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率［4］。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n = 6）

2.4 樣品含量測定

取樣品S1 - S8 各5.0 g，平行4 份，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果含量分別為0.448 7，0.209 2，0.037 7，0.229 4，0.410 3，1.088 7，0.359 8，0.292 6 mg/g。

3 討論

3.1 檢測波長選擇

預試驗對山柰酚的光譜吸收進行全波段掃描，結果顯示，山柰酚在199，365，265，511，715 nm 波長處均呈最大吸收，且其吸收強度大小為199 nm ＞365 nm ＞265 nm ＞715 nm ≈511 nm；分別采用前3個波長對對照品和樣品進行檢測，結果以365 nm 為檢測波長時目標峰峰形更好、分離度均更高且符合藥典標準。因此，本研究中采用365 nm作為檢測波長。

3.2 樣品制備研究

預試驗中，取同一采收期內的連翹，分別采用蒸法和煮法加工，適宜溫度干燥后分別測定揮發油、連翹苷、連翹酯苷A含量及蒸液和煮制液中連翹苷和連翹酯苷A的含量，結果，蒸法樣品的各指標均合格；而煮法樣品的揮發油含量不合格，連翹苷和連翹酯苷A含量雖合格但低于蒸法樣品；且蒸液中連翹苷和連翹酯苷A的含量均低于煮制液。再對煮法工藝和蒸法工藝分別進行研究，以煮制時間、煮制加水量、干燥溫度及蒸制時間、干燥溫度為指標進行工藝考察，結果煮制品揮發油含量均不合格，而蒸制最佳工藝為蒸15 min，50 ℃干燥36 h。因此，本研究中采用上述最佳蒸制工藝進行樣品制備。

3.3 樣品質量評價

預試驗中對樣品進行質量考察時發現，樣品間的雜質、水分、總灰分及浸出物含量差異均無統計學意義（P＞0.05），說明其符合藥典標準，具有均一性，且不影響山柰酚含量的檢測；各樣品的揮發油、連翹苷及連翹酯苷A 含量差異較大（P＜0.05），且與山柰酚含量呈同向變化趨勢，推測其可能與產地、海拔及采收期的影響有關，影響機制有待進一步研究。

3.4 試驗設計分析

結合2020 年版《中國藥典（一部）》［1］223及其他文獻［5-9］報道，本試驗原計劃采用HPLC 法同時測定連翹中黃酮類成分槲皮素、異鼠李素和山柰酚的含量，但結果欠佳。一方面，異鼠李素含量太低（1.3 kg連翹浸膏中僅含3.4 mg［10］），低于本研究中所用儀器的檢測限；另一方面，槲皮素的供試品溶液穩定性很差，室溫靜置12 h后峰面積減少了30.3%，這與文獻［11］報道結果不一致，即使采用了相同的供試品溶液制備方法，即甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）混合溶液加熱回流提取效果仍未提升；推測其可能與連翹組分性質或pH［12］有關，或需采用超聲［13］、醇提酸水解［1］230等方法提取才能保證槲皮素含量的穩定。

3.5 產地對山柰酚含量的影響

十堰市鄖西縣處于華北自然區域和華中自然區域之間，屬副熱帶北界大陸性季風氣候，四季分明，雨量適中，日照充足，無霜期長，氣候溫和，特別適合人類居住和動植物生長［14］。但由于東西部跨度115 km，縣域內錯綜分布有眾多山、丘、谷、壩，局部地方還有巖溶（喀斯特）地貌，海拔落差大（1.57～1 853 m［15］），因此全縣氣候不均衡，特別是春季，雖氣溫回升快，但降水少，氣溫起伏不定，冷空氣活動頻繁。本研究中的藥材樣品采自十堰市鄖西縣三官洞林區及上津鎮，兩地相隔約50 km，南北跨度約30 km，產地海拔426～1 246 m，同時受“倒春寒”天氣影響，各產地家種連翹的山柰酚含量存在一定差異。

3.6 方法評價

本研究中建立了測定湖北省十堰市鄖西縣不同產地家種連翹中山柰酚含量的HPLC法，該方法靈敏、可重復，測定結果準確，可用于家種連翹中山柰酚含量的測定，并為連翹質量控制方法的優化提供了參考；但需注意，該縣不同產地家種連翹中山柰酚含量差異較大。