LncRNA FEZF1-AS1靶向調控miR-200c-3p對人肺成纖維細胞生物學行為的影響

滿君 高艷艷 宋龍飛 高福生

摘要：目的 探討FEZ家族鋅指1-反義RNA1（LncRNA FEZF1-AS1）靶向調控miR-200c-3p對人肺成纖維細胞HLF生物學行為的影響。方法 采用轉化生長因子β1（TGF-β1）誘導HLF向肌成纖維細胞轉化，分為空白對照組（Blank組）和造模組（HLF+TGF-β1組），另根據轉染質粒不同將細胞分為Blank組、TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組和TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組。采用Western blot法檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）和波形蛋白（Vimentin）蛋白的表達。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測LncRNA FEZF1-AS1和miR-200c-3p的表達。采用CCK-8法檢測細胞增殖，細胞劃痕實驗檢測遷移能力，Transwell實驗檢測侵襲能力；采用雙螢光素酶實驗檢測FEZF1-AS1與miR-200c-3p的靶向作用關系。結果 與Blank組比較，HLF+TGF-β1組α-SMA、CollagenⅠ、Vimentin蛋白表達及LncRNA FEZF1-AS1表達水平升高，miR-200c-3p表達水平降低（P＜0.05）；與TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組比較，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組細胞增殖、遷移、侵襲能力下降，LncRNA FEZF1-AS1表達及α-SMA、CollagenⅠ、Vimentin蛋白表達水平降低，miR-200c-3p表達水平升高（P＜0.05）；FEZF1-AS1與miR-200c-3p基因序列上存在結合位點。結論 LncRNA FEZF1-AS1通過抑制miR-200c-3p促進特發性肺間質纖維化的發生、發展。

關鍵詞：特發性肺間質纖維化；肺成纖維細胞；肌成纖維細胞；FEZ家族鋅指1-反義RNA1；微小RNA-200c-3p

中圖分類號：R563.9文獻標志碼：ADOI：10.11958/20230719

The effect of lncRNA FEZF1-AS1 targeting regulation of miR-200c-3p on biological

behaviors of human lung fibroblasts

MAN Jun1， GAO Yanyan1， SONG Longfei2， GAO Fusheng1△

1 Department of Respiratory Medicine， 2 Department of Rehabilitation Medicine， Affiliated Hospital of Weifang Medical University， Weifang 261035， China

△Corresponding Author E-mail： gaofs888@163.com

Abstract： Objective To investigate the effect of FEZ family zinc finger 1-antisense RNA 1 （LncRNA FEZF1-AS1） targeting regulation of miR-200c-3p expression on biological behaviors of human lung fibroblasts （HLF）. Methods Transforming growth factor β1 （TGF-β1） was used to induce the transformation of HLF into myofibroblasts， which were divided into the Blank group and the model group （HLF+TGF-β1 group）. According to different transfection plasmid， cells were divided into the Blank group， the TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC group and the TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 group. The protein expressions of α-SMA， Collagen Ⅰ and Vimentin were detected by Western blot assay. The expressions of LncRNA FEZF1-AS1 and miR-200c-3p were detected by quantitative real-time PCR （qRT-PCR）.? Cell proliferation ability was detected by CCK-8 method， migration ability was detected by cell scratch experiment and invasion ability was detected by Transwell assay. The targeting relationship between FEZF1-AS1 and miR-200c-3p was detected by dual-luciferase reporter assay. Results Compared with the Blank group， protein expressions of α-SMA， Collagen Ⅰ， Vimentin and the expression of LncRNA FEZF1-AS1 were increased in the HLF+TGF-β1 group （P＜0.05）， and the expression of miR-200c-3p was decreased （P＜0.05）. Compared with the TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC group， cell proliferation， migration， invasion ability， LncRNA FEZF1-AS1 expression， protein expressions of α-SMA， Collagen Ⅰ and Vimentin were decreased in the TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 group （P＜0.05）， and the expression of miR-200c-3p was increased （P＜0.05）. There were binding sites between miR-200c-3p and FEZF1-AS1 gene sequence. Conclusion LncRNA FEZF1-AS1 promotes the formation and progression of idiopathic pulmonary interstitial fibrosis by inhibiting miR-200c-3p.

Key words： idiopathic pulmonary interstitial fibrosis；lung fibroblasts; myofibroblasts; FEZ family zinc finger 1-antisense RNA1；microRNA-200c-3p

特發性肺間質纖維化（IPF）是呼吸系統疑難疾病，肺泡上皮細胞反復損傷、異常修復和成纖維細胞激活是IPF病理過程的關鍵因素，其導致上皮間質轉化（EMT）過程被異常啟動［1］。IPF患者確診后存活期僅為3年左右，5年生存率為30%～50%，吡非尼酮和尼達尼布可以緩解IPF的進展，但目前尚無被廣泛接受的治療IPF方法［2-4］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一類長度超過200 nt的非編碼RNA，參與生物體內各種重要的生理過程［5］。FEZ家族鋅指1-反義RNA 1（LncRNA FEZF1-AS1）在肝癌、結腸癌等多種惡性腫瘤中過表達，可促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲過程，調控腫瘤細胞EMT［6］。miRNA參與多種生物學功能的調控，研究發現miR-200c-3p在肝纖維化、心肌梗死、腫瘤等疾病的發病機制中均發揮重要作用［7-8］。然而，LncRNA FEZF1-AS1在IPF中的表達情況及作用機制研究尚鮮見，且LncRNA FEZF1-AS1是否通過miR-200c-3p發揮作用尚不清楚。本研究分析了LncRNA FEZF1-AS1在IPF中的表達模式和生物學功能，探討IPF的發病機制，為尋找有價值的治療靶點提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞及培養 人肺成纖維細胞HLF購自中國科學研究院昆明細胞庫（KCB 200695），HLF細胞培養于含10%胎牛血清、0.1 g/L鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM/F12培養基中，以5%CO2、37 ℃飽和濕度環境下在恒溫培養箱中培養，每1～2 d將細胞換液1次，當細胞融合度達80%時進行消化傳代，取對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 轉化生長因子β1（TGF-β1）（CA59，上海近岸生物科技有限公司）；胎牛血清［cat：10099141，賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；DMEM/F12液體培養基（SH30023.01，思拓）；CCK-8檢測試劑盒（CK04，同仁化學研究所）；Transwell嵌套小室（3422，康寧公司）；TRIzol（H10318）和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒（AQ131-01）均購自北京全式金生物技術股份有限公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒和Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒（C10211-1）購自蘇州銳博生物科技有限公司；Si LncRNA FEZF1-AS1轉染質粒（siB160705032412）、Si LncRNA FEZF1-AS1 NC（對照）轉染質粒（siN0000001-1-1）、miR-200c-3p引物序列（MQPS0000783-1-100）均購自廣州市銳博生物科技有限公司；Lipo6000TM 轉染試劑（C0526-1.5ml）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）、波形蛋白（Vimentin）及GAPDH抗體均購自Proteintech；辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的二抗、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；螢光素酶檢測試劑盒購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

1.2.2 主要儀器 CO2培養箱（XD-101，日本SANYO）；酶標儀（MULTISKAN FC，美國Thermo）；離心機（centrifuge 5415R，Eppendorf）；電泳儀（EPS300，Tanon）；qRT-PCR儀（7500，ABI）；96微孔板發光檢測儀（GloMax，Promega）。

1.3 方法

1.3.1 細胞造模、轉染及分組 將10 mg/L TGF-β1采用DMEM/F12液體培養基稀釋500倍即形成質量濃度為20 μg/L的TGF-β1，誘導肺成纖維細胞，促使其異?；罨蚣〕衫w維細胞轉化，將細胞分為空白對照組（Blank組，HLF細胞不進行任何處理）和造模組（HLF+TGF-β1組）。

取對數生長期HLF細胞接種于6孔板內，每孔2×106個細胞，當細胞融合度達70%～90%時進行轉染，參照Lipofectamine6000TM試劑盒說明書進行轉染，構建Si LncRNA FEZF1-AS1轉染質粒及對照質粒，采用qRT-PCR法檢測LncRNA FEZF1-AS1的表達水平，從而檢測細胞轉染效率，用于后續實驗的開展。

將轉染Si LncRNA FEZF1-AS1轉染質粒及對照質粒的HLF細胞加入20 μg/L TGF-β1，分為TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組和TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組，另設空白對照組（Blank組，HLF細胞不進行任何處理），進行后續實驗觀察LncRNA FEZF1-AS1對細胞的影響。

1.3.2 Western blot檢測α-SMA、Collagen Ⅰ、Vimentin蛋白的表達 各組細胞采用裂解液裂解，裂解完成后，在4 ℃下12 000 r/min離心15 min，提取細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液煮沸5 min，放于-80 ℃保存。SDS-PAGE分離后，采用濕轉法轉到PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡PVDF膜，室溫下搖床封閉2 h，加入α-SMA、Collagen Ⅰ一抗（1∶1 000）、Vimentin一抗（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，TBST充分洗滌PVDF膜后加入HRP標記山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000），于37 ℃搖床孵育2 h。TBST再次洗滌后加入ECL顯影，Image J軟件進行灰度值分析，GAPDH作為內參蛋白，計算目的蛋白表達量。目的蛋白表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.3.3 qRT-PCR法檢測LncRNA FEZF1-AS1和miR-200c-3p表達 將細胞接種于6孔板內，每孔2×105個細胞，采用TRIzol法提取總RNA，分別應用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒及miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作將RNA反轉錄成cDNA。反應體系（20 μL）：上、下游引物各0.4 μL，2×Supermix 10 μL，PASSIVE DYE 0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析，分別以GAPDH和U6作為內參計算LncRNA FEZF1-AS1 mRNA和miR-200c-3p的表達量，實驗重復3次。引物序列見表1。

1.3.4 CCK-8法檢測LncRNA FEZF1-AS1對細胞增殖的影響 HLF細胞轉染24 h后，胰酶消化細胞，調整細胞密度為4×104個/mL，將100 μL的細胞懸液接種于96孔板中，加入20 μg/L TGF-β1，置于5%CO2、37 ℃培養箱中培養。分別在培養0 h、24 h、48 h時每孔加入10 μL CCK-8溶液，再次置于細胞培養箱中孵育4 h，使用酶標儀測定各個孔在450 nm波長下的光密度（OD）值。

1.3.5 細胞劃痕實驗檢測LncRNA FEZF1-AS1對細胞遷移能力的影響 HLF細胞轉染24 h后，按細胞密度2×105個/mL接種至6孔板，加入20 μg/L TGF-β1，細胞生長至鋪滿孔底后，用10 μL移液器吸頭垂直在細胞板上劃痕，充分洗去漂洗細胞，加入無血清的培養基，置于CO2培養箱中繼續培養。倒置顯微鏡下觀察各組細胞0 h、48 h的變化，拍照記錄劃痕面積。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕面積-48 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.3.6 Transwell小室法檢測LncRNA FEZF1-AS1對細胞侵襲能力的影響 胰酶消化細胞，制備細胞懸液，將細胞接種于小室中，調整細胞密度為2×105個/mL，每組細胞數為1×104個/孔。Transwell上室加入無血清培養基，下室加入含20 μg/L TGF-β1和10%血清的完全培養基，上室液每孔200 μL，下室液每孔800 μL。將上層小室放入下層小室，細胞計數后將細胞鋪在上層小室中。在培養箱中培養48 h后，取出上室，用棉簽擦去上室底部膜表面的細胞，用PBS洗滌，然后將其置于800 μL甲醇中固定，10 min后采用吉姆薩染色液染細胞，去離子水進行適度漂洗，去除浮色，最后熒光倒置顯微鏡計數、拍照。

1.3.7 雙螢光素酶實驗驗證FEZF1-AS1與miR-200c-3p的靶向作用關系 將FEZF1-AS1基因插入到螢光素酶基因上游，構建FEZF1-AS1-WT（野生型）、FEZF1-AS1-Mut（突變型）的雙螢光素酶報告質粒，采用NC mimic質粒及miR-200c-3p mimic質粒，與FEZF1-AS1-WT、FEZF1-AS1-Mut質粒共轉染HLF細胞，最終得到FEZF1-AS1-WT+NC mimic組、FEZF1-AS1-WT+miR-200c-3p mimic組、FEZF1-AS1-Mut+NC mimic組、FEZF1-AS1-Mut+miR-200c-3p mimic組。轉染后將細胞培養48 h，收集細胞，加入細胞裂解液，使用雙螢光素酶報告基因檢測系統檢測各組細胞螢火蟲和海腎熒光強度，以海腎熒光值作為內參，計算各組細胞螢光素酶活性的比值。

1.4 統計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（[x] ±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Blank組和HLF+TGF-β1組細胞α-SMA、Collagen Ⅰ、Vimentin蛋白表達水平 HLF+TGF-β1組細胞α-SMA、CollagenⅠ、Vimentin蛋白表達水平均高于Blank組（P＜0.05），見表2、圖1。

2.2 Blank組和HLF+TGF-β1組細胞LncRNA FEZF1-AS1、miR-200c-3p表達 與Blank組相比，HLF+TGF-β1組細胞LncRNA FEZF1-AS1表達水平升高（2.23±0.05 vs. 1.11±0.01，n=3，t=24.260，P＜0.05），miR-200c-3p表達水平降低（0.20±0.01 vs. 1.10±0.03，n=3，t=33.740，P＜0.05）。

2.3 Blank組、Si LncRNA FEZF1-AS1轉染質粒組和對照質粒組LncRNA FEZF1-AS1的表達水平 與Blank組（1.00±0.05）和Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組（1.01±0.10）相比，Si LncRNA FEZF1-AS1組（0.31±0.02）LncRNA FEZF1-AS1表達水平降低（n=3，F=36.360，P＜0.05）。

2.4 沉默LncRNA FEZF1-AS1表達對細胞增殖的影響 CCK-8實驗結果顯示，與Blank組相比，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組24、48 h細胞增殖能力升高（P＜0.05）；與TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組相比，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組24、48 h細胞增殖能力降低（P＜0.05）；3組細胞0、24、48 h細胞增殖能力依次升高（P＜0.05），見表3。

2.5 沉默LncRNA FEZF1-AS1表達對細胞遷移的影響 細胞遷移實驗結果顯示，與Blank組相比，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組細胞劃痕愈合率升高（P＜0.05）；與TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組比較，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組細胞劃痕愈合率降低（P＜0.05），見表4、圖2。

2.6 沉默LncRNA FEZF1-AS1表達對細胞侵襲的影響 Transwell實驗表明，與Blank組相比，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組細胞侵襲數升高（P＜0.05）；與TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組相比，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組細胞侵襲數降低（P＜0.05），見表4、圖3。

2.7 沉默LncRNA FEZF1-AS1表達對肺間質纖維化相關蛋白表達的影響 與Blank組相比，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組Vimentin、α-SMA、CollagenⅠ蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組相比，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組Vimentin、α-SMA、CollagenⅠ蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖4、表5。

2.8 沉默LncRNA FEZF1-AS1表達對miR-200c-3p表達的影響 與TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組比較，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組LncRNA FEZF1-AS1表達水平降低，miR-200c-3p表達水平升高（P＜0.05），見表6。

2.9 雙螢光素酶實驗檢測LncRNA FEZF1-AS1與miR-200c-3p的關系 采用RNAhybrid軟件預測LncRNA FEZF1-AS1與miR-200c-3p具有結合位點，見圖5。FEZF1-AS1-WT+miR-200c-3p mimic組螢光素酶活性低于FEZF1-AS1-WT+NC mimic組（0.44±0.01 vs. 1.00±0.01，n=3，t=58.460，P＜0.05）；FEZF1-AS1-Mut+miR-200c-3p mimic組螢光素酶活性與FEZF1-AS1-Mut+NC mimic差異無統計學意義（0.95±0.03 vs. 1.00±0.05，n=3，t=1.415，P＞0.05）。

3 討論

IPF的病理過程與EMT激活和成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化等密切相關，成纖維細胞可分泌大量促纖維化因子以及膠原為代表的細胞外基質，這些物質可繼續作用于成纖維細胞，發揮正反饋作用［9］。LncRNA參與染色體沉默、染色質修飾、轉錄激活與干擾等過程，這些過程與人類疾病的發生和發展密切相關［10］。目前研究發現LncRNA FEZF1-AS1在胰腺癌、結直腸癌、肺腺癌等多種惡性腫瘤中高表達，且與患者不良預后相關［6，11］。作為一種癌基因，LncRNA FEZF1-AS1可促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲［12］。LncRNA FEZF1-AS1可促進非小細胞肺癌（NSCLC）細胞增殖、遷移和侵襲能力，且其在NSCLC中通過抑制E-cadherin表達及調節Wnt/β-catenin通路增強EMT［13］。另有研究發現，LncRNA FEZF1-AS1通過調控miR-25-3p/ITGB8軸促進前列腺癌細胞EMT［14］。在肝癌中LncRNA FEZF1-AS1可通過JAK2/STAT3信號通路促進EMT，從而促進肝癌細胞的侵襲和轉移［15］。然而，目前鮮見有關LncRNA FEZF1-AS1在IPF中作用的研究。本研究結果顯示，LncRNA FEZF1-AS1在肺間質纖維化細胞中表達上調，提示LncRNA FEZF1-AS1可能與肺間質纖維化的發生有關；沉默肺間質纖維化細胞中LncRNA FEZF1-AS1表達后，細胞增殖、遷移和侵襲能力降低，表明LncRNA FEZF1-AS1在肺間質纖維化中發揮促纖維化基因的作用。

α-SMA是成纖維細胞表達的微絲蛋白，亦是肺成纖維細胞向肌成纖維細胞分化的標志蛋白，故肺間質纖維化中α-SMA蛋白表達水平顯著升高。CollagenⅠ為細胞外基質主要成分之一，異常膠原沉積是肺間質纖維化的重要特征，故IPF中CollagenⅠ蛋白表達水平顯著升高。Vimentin是間質細胞的標志蛋白，具有維持細胞形態穩定，促進細胞黏附、侵襲與轉移等作用。本研究結果顯示，肺間質纖維化細胞中α-SMA、CollagenⅠ和Vimentin表達明顯升高，且沉默LncRNA FEZF1-AS1表達后，細胞α-SMA、CollagenⅠ、Vimentin表達水平降低，提示沉默LncRNA FEZF1-AS1表達后，肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化可能受到抑制，進而抑制了肺間質纖維化細胞的增殖、遷移和侵襲。由此筆者推測，LncRNA FEZF1-AS1通過調控細胞增殖、遷移、侵襲與肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，從而促進肺間質纖維化發生、發展。

miRNA可選擇性與mRNA結合，抑制mRNA翻譯或促進mRNA降解，從而調控靶基因表達。有研究報道，miR-200c-3p通過逆轉肺成纖維細胞的纖維原活性及抑制肺泡Ⅱ型上皮細胞向肺泡Ⅰ型上皮細胞的轉化，進而抑制肺間質纖維化［16］。LncRNA通過海綿效應調控miRNA表達來參與腫瘤發生、發展。Lin等［17］研究表明，IPF中LncRNA Hoxaas3高表達可下調miR-450b-5p，上調Runx1表達，從而促進肺成纖維細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結果顯示，miR-200c-3p在肺間質纖維化細胞中表達水平降低，且LncRNA FEZF1-AS1與miR-200c-3p存在靶向關系，沉默LncRNA FEZF1-AS1后細胞中miR-200c-3p表達水平升高，提示LncRNA FEZF1-AS1基因可靶向抑制miR-200c-3p基因表達，促進肺間質纖維化發生、發展。

綜上所述，LncRNA FEZF1-AS1基因通過靶向抑制miR-200c-3p促進成纖維細胞增殖、轉移、侵襲及向肌成纖維細胞轉化，從而促進肺間質纖維化。本研究僅初步探討了LncRNA FEZF1-AS1基因調控miR-200c-3p對肺成纖維細胞生物學行為的影響，該結論未在動物體內進行驗證，后續研究將利用小鼠肺纖維化模型進行臨床前分析。

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（2023-05-19收稿 2023-08-12修回）

（本文編輯 陳麗潔）