液態芯片技術篩選胸腔積液細胞因子對結核性胸膜炎的診斷價值

杜鳳嬌 杜博平 賈紅彥 邢愛英 李自慧 朱傳智 李華

摘要：目的 應用液態芯片技術篩選結核性胸膜炎（plTB）胸腔積液結核特異性細胞因子建立診斷模型，并探討其應用價值。方法 納入plTB患者（plTB組）86例，其中確診plTB組41例，臨床診斷plTB組45例；其他胸腔積液患者（對照組）42例。采用液相芯片技術分析胸腔積液17個細胞因子，包括白細胞介素（IL）-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、γ-干擾素誘導蛋白10（IP-10）、IL-15、IL-17F、IL-27、腫瘤壞死因子（TNF）-α、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、巨噬細胞炎癥蛋白-3a（MIP-3α）、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、β-干擾素（IFN-β）的表達量。篩選確診plTB組和對照組組間差異因子，并在確診plTB患者中繪制受試者工作特征（ROC）曲線，將AUC＞0.850、特異度＞80%的IP-10、IL-27和MCP-1聯合診斷plTB，并同胸腔積液腺苷酸脫氨酶（ADA）檢測和結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）比較，評估診斷效能。結果 確診plTB組IL-2、IP-10、IL-27、TNF-α和MCP-1水平均高于對照組（P＜0.05）；IP-10、IL-27和MCP-1三因子聯合確診plTB的敏感度為87.8%，特異度為81.0%；三因子聯合診斷在45例臨床診斷plTB組中的敏感度仍高達86.7%，與確診plTB組的敏感度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。plTB組中，TIP-10、IL-27和MCP-1三因子聯合檢測的敏感度為87.2%，高于T-SPOT.TB單獨檢測（81.4%）和ADA單獨檢測（54.7%）。結論 應用液態芯片技術對胸腔積液IP-10、IL-27和MCP-1聯合檢測，可為plTB診斷提供幫助。

關鍵詞：結核；胸腔積液；胸膜炎；白細胞介素-27；液態芯片技術；γ-干擾素誘導蛋白10；單核細胞趨化蛋白-1

中圖分類號：R521文獻標志碼：ADOI：10.11958/20230793

Study on the value of screening cytokines in pleural effusion by liquid array technology in the diagnosis of tuberculous pleurisy

DU Fengjiao1， DU Boping1， JIA Hongyan1， XING Aiying1， LI Zihui1， ZHU Chuanzhi1， LI Hua2△

1 Beijing Key Laboratory of Drug Resistance Tuberculosis Research， Beijing 101149， China; 2 Department of Tuberculosis Two， Beijing Chest Hospital， Capital Medical University， Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute

△Corresponding Author E-mail： lhlbw1997@hotmail.com

Abstract： Objective To screen the specific cytokines of tuberculous pleural effusion （plTB） by using liquid array technique to establish a diagnostic model and discuss its application value. Methods A total of 86 patients with plTB （plTB group） were included， including 41 patients in the confirmed plTB group and 45 patients in the clinically diagnosed plTB group. There were 42 other patients with pleural effusion in the control group. Seventeen cytokines in pleural effusion were analyzed by liquid array technology. Interleukin （IL） -1β， IL-2， IL-4， IL-5， IL-6， IL-8， IL-9， IL-10， gamma-interferon-induced protein 10 （IP-10）， IL-15， IL-17F， IL-27， tumor necrosis factor （TNF） -α， monocyte chemotactic protein-1 （MCP-1）， the expression levels of macrophage inflammatory protein-3a （MIP-3α）， macrophage colony-stimulating factor （M-CSF） and β-interferon （IFN-β） were detected. Difference factors between the confirmed plTB group and the control group were screened， and the receiver operating characteristic （ROC） curve was drawn in the confirmed plTB patients. IP-10， IL-27 and MCP-1 with AUC > 0.850 and specificity > 80% were combined to diagnose plTB， and were compared with adenylate deaminase （ADA） and T-SPOT.TB in pleural effusion to evaluate the diagnostic efficacy. Results The levels of IL-2， IP-10， IL-27， TNF-α and MCP-1 were higher in the confirmed plTB group than those in the control group （P＜0.05）. The sensitivity and specificity of IP-10， IL-27 and MCP-1 in the diagnosis of plTB were 87.8% and 81.0%. The sensitivity of three-factor combined diagnosis in 45 patients with plTB was still as high as 86.7%， and there was no significant difference in sensitivity compared with that in the diagnosed plTB group （P＞0.05）. In the plTB group， the sensitivity of IP-10， IL-27 and MCP-1 combined detection was 87.2%，which was higher than that of T-SPOT.TB （81.4%） and ADA （54.7%）. Conclusion The application of liquid array technology to the joint detection of pleural effusion IP-10， IL-27 and MCP-1 can provide help for the diagnosis of plTB.

Key words： tuberculosis; pleural effusion; pleurisy; interleukin-27; liquid array technology; IP-10; MCP-1

結核?。╰uberculosis，TB）是僅次于新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的第二大致死性傳染病，位列全球疾病死因第13位［1］。結核性胸膜炎（tuberculous pleurisy，plTB）是一種常見的TB類型，發病率呈上升趨勢。plTB可引起胸膜增厚、結核性膿胸、乳糜胸、氣胸等并發癥，導致肺功能損害、慢性胸痛或呼吸困難，對患者造成極大傷害。早期診斷是控制plTB的關鍵環節［2-3］。細菌學和病理學結果是plTB診斷的金標準，但抗酸桿菌涂片檢測陽性率低于5.8%，結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）培養周期長（4～8周），而組織病理學檢查多為有創，因此都不適于普及。分子生物學檢測技術仍存在假陽性及技術等方面問題，難以推廣［4］。近年來，偶有潛在細胞因子可診斷plTB的研究［5］。液態芯片技術（Luminex）可多指標并行分析，具有操作簡便、靈敏度高、通量高等優點，為疾病特異性標志物的發現和新診斷方法的建立提供了研究思路和平臺［6］。目前尚缺乏胸腔積液大樣本、同時檢測多個細胞因子的相關研究。本研究應用液態芯片技術檢測胸腔積液細胞因子，篩選plTB敏感度高、特異度好的輔助診斷標志物，并同傳統的胸腔積液腺苷酸脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）檢測及結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）比較，評估其臨床應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018年7月—2021年12月在北京胸科醫院住院或門診就診的X線檢查顯示有胸腔積液，疑似結核性胸膜炎的患者155例。收集患者病歷資料，剔除資料不全和診斷不明確者27例，最終納入128例患者，其中男80例，女48例，年齡18～86歲，中位年齡54（37，66）歲；分為plTB組（86例）和對照組（42例）。plTB組男54例，女32例，年齡18～86歲，中位年齡44（33，59）歲，26例合并肺結核，13例合并糖尿病。依據WS196—2017肺結核診斷指南［7］，將病原學（包括細菌學和分子生物學）或病理學確診的plTB者作為確診plTB組（41例），臨床診斷plTB者作為臨床診斷plTB組（45例）。對照組為確診其他胸膜疾病，排除plTB，且既往無TB史和結核接觸史，均未經過放化療和手術治療者，包括肺癌39例（腺癌26例、鱗癌5例和小細胞癌8例），胸膜間皮瘤2例和細菌性胸膜炎1例；男26例，女16例，年齡26～76歲，中位年齡64（57，72）歲；5例合并糖尿病。以上患者均無妊娠、嚴重肝腎功能損害、急性病毒感染、肝炎、人免疫缺陷病毒感染和免疫抑制劑應用史。本研究通過首都醫科大學附屬北京胸科醫院倫理委員會批準，批件號：（2021）年臨床審第（06）號。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 Human 17-plex免疫因子分析試劑盒（美國Panomics公司）；T-SPOT.TB試劑盒（英國Oxford Immunotech公司）；Luminex20液相芯片分析儀（美國Millipore公司）；5417R低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；705超低溫冰箱（日本三洋公司）。

1.2.2 樣品采集及處理 收集2 h內采集的每位患者胸腔積液2 mL于EP管中，4 ℃、10 000×g離心5 min后，收集上清液于1.5 mL EP管，-80 ℃凍存備用。

1.2.3 液相芯片分析胸腔積液的細胞因子水平 按照試劑盒說明書稀釋標準品、質控品、偶聯抗體珠。96孔板每孔加入洗液200 μL，室溫避光水平振搖10 min。棄上清液，吸水紙上拍凈。制備2 000、400、80、16、3.2和0 ng/L的標準品加入對應孔，然后將室溫平衡的樣本加入對應孔后，加入預混磁珠25 μL，避光，4 ℃振搖2 h。在磁性板架上棄上清液，洗板2次。每孔加入檢測抗體25 μL，室溫避光振搖1 h。每孔加入鏈親和霉素-藻紅蛋白25 μL，避光室溫振搖30 min，洗板2次。每孔加入150 μL鞘液重懸磁珠，避光室溫振搖? ? ? 5 min，在液相芯片分析儀上檢測白細胞介素（IL）-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、γ-干擾素誘導蛋白10（interferon-gamma inducible protein of 10，IP-10）、IL-15、IL-17F、IL-27、腫瘤壞死因子（TNF）-α、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、巨噬細胞炎癥蛋白-3a（MIP-3α）、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、β-干擾素（IFN-β）共17個細胞因子的表達量。

1.2.4 T-SPOT.TB檢測 按照T-SPOT.TB試劑盒說明書進行操作。用肝素抗凝管采集4 mL外周血，4 h內用淋巴細胞分離液分離得到外周血單個核細胞并制備成2.5×106/mL的細胞懸液。分別取100 μL細胞懸液放于空白對照孔（無血清培養基）、陽性對照孔（植物血凝素）、早期分泌靶向抗原（early secretory antigenic target，ESAT）-6和培養濾液蛋白（culture flit protein，CFP）-10孔中進行過夜培養，通過美國CTL公司的酶聯免疫斑點系統（CTL ImmunoSpop S5 Versa Analyzer）計數斑點形成細胞（spots forming cells，SFCs）。結果判定標準：當空白對照孔SFCs＜6時，ESAT-6或CFP-10任一個實驗孔SFCs≥6即為陽性；若空白對照孔SFCs≥6，ESAT-6或CFP-10任一個實驗孔SFCs≥2倍空白孔SFCs，結果為陽性；若空白對照孔內SFCs≥10或陽性對照孔內SFCs＜20，試驗無效。

1.2.5 ADA測定 采用抗凝管收集10 mL胸腔積液，1 000×g離心5 min，取上清液，用酶法（北京九強生物技術股份有限公司試劑盒）測定ADA活性，參照試劑盒說明書進行診斷，ADA≥45 U/L定義為陽性。

1.3 統計學方法 采用SPSS 24.0軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以[x] ±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數資料以例（%）表示，3組間陽性率比較采用Cochrans Q檢驗，組間多重比較采用配對χ2檢驗，繪制受試者工作特征（ROC）曲線。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 確診plTB組和對照組胸腔積液的細胞因子水平比較 確診plTB組IL-2、IP-10、IL-27、TNF-α和MCP-1水平均高于對照組（P＜0.05），確診plTB組IL-6水平低于對照組（P＜0.05），見表1。

2.2 胸腔積液IL-2、IL-6、IP-10、IL-27、TNF-α和MCP-1對確診plTB的診斷效能 各因子單獨診斷41例確診plTB的AUC、敏感度和特異度見圖1、表2。將AUC＞0.850且特異度＞80%的IP-10、IL-27和MCP-1聯合確診plTB，其中任一因子為陽性則判定為聯合診斷陽性，三因子均為陰性則判定為聯合診斷陰性，聯合確診plTB的敏感度為87.8%（36/41），特異度為81.0%（34/42）。三因子聯合診斷在45例臨床診斷plTB患者中的敏感度仍高達86.7%（39/45），與確診plTB組的敏感度比較，差異無統計學意義（χ2=0.025，P＞0.05）。三因子聯合診斷plTB的敏感度為87.2%（75/86），特異度為81.0%（34/42）。

2.3 各指標診斷效能比較 IP-10、IL-27和MCP-1三因子聯合檢測和T-SPOT.TB的敏感度均高于ADA檢測（Cochrans-Q=39.813，χ2分別為12.777和57.695，P＜0.01），且三因子聯合檢測的敏感度高于T-SPOT.TB（χ2=11.631，P＜0.01）；三因子聯合檢測、T-SPOT.TB和ADA檢測的特異度差異無統計學意義（Cochrans-Q=6.000，P＞0.05），見表3。

3 討論

plTB是M.tb及其代謝產物由近胸膜的原發病灶直接波及胸膜，或經血液、淋巴途徑傳播至胸膜而引起的滲出性炎癥，與機體復雜的細胞因子網絡被激發產生免疫反應有關。大量的胸腔積液降低了M.tb的濃度，從而導致胸腔積液M.tb體外培養陽性率極低［8］。宿主參與抗M.tb免疫應答中的各類細胞及其因子具有潛在的開發免疫學診斷試劑的價值［5］。鑒于傳統方法檢測免疫因子效能有限，僅有少數單個指標的研究報道。本研究應用液態芯片技術檢測胸腔積液中的17種免疫因子并進行比較，發現確診plTB組中IL-2、IP-10、IL-27、TNF-α和MCP-1水平均高于對照組，IL-6低于對照組，提示檢測胸腔積液中特異性免疫因子具有潛在診斷價值。

近年來新發現的二聚體細胞因子IL-27是IL-6/IL-12家族成員，由活化的單核細胞、巨噬細胞以及樹突狀細胞共同作用產生，與分布在免疫細胞上的受體結合，進而通過信號轉導和轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）1/STAT2通路調節T淋巴細胞向Th1方向分化和增殖。IL-27可有效識別并清除M.tb，可與結核性胸腔積液中存在的多種細胞因子發生作用并參與plTB的發生與發展［9-10］。劉佳慶等［11］也發現利用液相芯片技術對患者胸腔積液IL-27檢測在plTB診斷中存在一定的價值。在TB高流行地區，胸腔積液中IL-27對plTB有較好的診斷效果，且陰性結果排除plTB可能性較大［12］。本研究中，胸腔積液IL-27的診斷臨界值為4 589.00 ng/L，敏感度為75.61%，特異度為88.10%，顯示了較好的診斷價值。這可能是由于患者胸腔積液微環境改變，M.tb入侵，滲出液誘發局部超敏反應，使得IL-27水平增高所致［10］。

IP-10屬于趨化因子CXC亞家族，CXC趨化因子受體3（CXCR3）是其唯一的配體，可趨化高度表達CXCR3的多種炎性細胞，屬于Th1型細胞因子。其主要通過內皮細胞、成纖維細胞、淋巴細胞、單核巨噬細胞活化產生，可選擇性誘導白細胞表達整合素，誘導更多趨化因子產生，放大信號，產生強烈細胞反應，增加病灶內細胞濃度，損傷局部組織器官［13］。IL-2是一種淋巴激活因子，可促進T細胞的增殖、誘導細胞毒性T細胞的產生和增殖，在介導免疫反應中起關鍵作用［14］。研究顯示，胸腔積液IP-10和IL-2對plTB具有較高的診斷價值［13-14］。本研究中IP-10和IL-2診斷plTB的敏感度分別為80.49%和70.73%，特異度分別為88.10%和83.33%，提示檢測IP-10較IL-2診斷plTB的價值高。此外，IP-10和IL-2在人免疫缺陷病毒感染患者和兒童TB診斷中較γ-干擾素敏感度高［15-16］。MCP-1屬于趨化因子CC亞家族。在結核宿主免疫中，MCP-1能夠誘導結核的非特異性免疫反應和肉芽組織的形成過程，還具有促進單核/巨噬細胞合成和分泌TNF-α的特性，同時TNF-α可反過來刺激MCP-1在肺內的表達。這提示MCP-1與TNF-α不僅本身參與結核結節的形成，而且MCP-1與TNF-α在細胞因子網絡中有相互促進作用，這可能是結核結節形成的機制之一［17-19］。本研究結果提示單獨應用MCP-1較TNF-α鑒別診斷的可靠性高。

IL-6是一種多功能細胞因子，由T細胞、B細胞和單核細胞等多種細胞產生，并促進T細胞和B細胞的分化與增殖，在急性炎癥反應中起關鍵作用，如誘導產生一些急性期蛋白及合成免疫球蛋白，以助于感染早期γ-干擾素快速表達等［14，20］。有研究表明結核性胸腔積液中IL-6含量高于惡性胸腔積液，且高于自身外周血清［21］，可能由于胸膜腔受到M.tb感染時產生過敏反應，T細胞被激活，產生并分泌IL-6。本研究中IL-6診斷plTB的敏感度為68.29%，特異度為85.71%，檢測胸腔積液IL-6有助于鑒別診斷。

本研究應用液態芯片技術首先在確診plTB組與對照組間篩選出6個胸腔積液差異細胞因子，進而在plTB組中聯合檢測IL-6、IP-10和MCP-1，使得敏感度提高至87.8%，特異度為81.0%，且三因子聯合檢測在臨床plTB組中的敏感度仍高達86.7%，提示聯合檢測對plTB有輔助診斷價值，尤其對臨床plTB者具有潛在應用價值。

γ-干擾素釋放試驗是近20年來基于免疫和分子生物學發展起來的一種快速的體外檢測結核菌感染的新方法，被廣泛用于TB的輔助診斷?；谕庵苎獑蝹€核細胞的T-SPOT.TB將細胞調至2.5×106/mL，保障了實驗的準確性和敏感度。但是，在TB高負擔國家中結核潛伏感染率高，診斷特異度較低，常用于TB患者的排除，而非納入，且操作復雜、價格昂貴，限制了其常規臨床應用［5］。本研究中T.SPOT-TB診斷plTB的敏感度略低于IP-10、IL-27和MCP-1三因子聯合檢測。ADA檢測是臨床常規應用的、診斷plTB較為準確的輔助指標。ADA是嘌呤核苷酸分解代謝過程中的關鍵酶，主要存在于機體淋巴細胞中，當患者感染M.tb時，T細胞介導的免疫應答會使淋巴細胞明顯增高，ADA濃度也大幅提高［22］。本研究中ADA檢測、三因子聯合檢測和T.SPOT-TB的特異度差異均無統計學意義，但聯合檢測的敏感度高于ADA檢測。

綜上所述，應用液態芯片技術對IP-10、IL-27和MCP-1聯合檢測plTB具有較高的敏感度和特異度，且操作簡單、方便。因此，三因子聯合診斷具有潛在的臨床應用價值，但本研究納入的患者例數較少，尚需擴大樣本量進一步研究。

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（2023-05-25收稿 2023-09-04修回）

（本文編輯 李志蕓）